鹿茸補(bǔ)骨片對(duì)增加骨密度功能的試驗(yàn)研究

王 丹，孫敬蒙

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117；2.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院藥學(xué)部，長春 130021）

隨著我國人口老齡化程度的加劇，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率也隨之升高[1-2]，其最大的危害是骨質(zhì)疏松性骨折，且前臂遠(yuǎn)端骨折一直被認(rèn)為是典型的骨質(zhì)疏松性骨折[3-5]。骨密度作為骨質(zhì)疏松癥的預(yù)測(cè)指標(biāo)[6-8]，其保健食品的開發(fā)引起了醫(yī)藥工作者的高度關(guān)注，鹿茸補(bǔ)骨片主要采用吉林省道地藥材馬鹿茸與黃芪配伍為君藥[9]，《本草綱目》記載[10]，鹿茸能夠起到養(yǎng)血益陽，強(qiáng)筋健骨，治一切虛損、耳聾、目暗、眩暈虛痢作用[11-12]。為進(jìn)一步證實(shí)鹿茸補(bǔ)骨片增加骨密度的功能，本研究綜合分析了其對(duì)骨密度及骨鈣含量等指標(biāo)的影響，并對(duì)鹿茸補(bǔ)骨片進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，初步對(duì)原料毒性特性進(jìn)行評(píng)估，本文研究內(nèi)容可為鹿茸補(bǔ)骨片保健食品的研發(fā)及增加骨密度機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與條件 SPF 級(jí)SD 大鼠和SPF 級(jí)ICR小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（屏障環(huán)境）飼養(yǎng)（許可證號(hào)：SYXK（黑）2011007），溫度為21 ～23 ℃，濕度為55%～58%。試驗(yàn)動(dòng)物所用的清潔級(jí)飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司（許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0010）。

1.2 樣品 鹿茸補(bǔ)骨片，由哈爾濱久盛醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，以馬鹿茸、黃芪、骨碎補(bǔ)、熟地黃為原料，樣品為異形片劑，0.53 g/片（約每片含生藥馬鹿茸0.24 g，黃芪0.78 g，骨碎補(bǔ)0.52 g，熟地黃0.78 g），推薦成人（60 kg 計(jì)）用量為2 片/次，2 次/d。

1.3 儀器與試劑 雙能X 線骨密度儀（上海伊沐醫(yī)療器械有限公司）、原子吸收分光光度計(jì)（北京達(dá)豐瑞儀器儀表有限公司）、電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、精密卡尺（東莞市三本精密儀器源頭廠）、動(dòng)物解剖器械、灌胃針、注射器等均購自吉林省金泰化玻有限公司；主要試劑如硝酸、高氯酸為優(yōu)級(jí)純，氧化鑭、碳酸鈣及鹽酸等均為分析純由吉林省金泰化玻有限公司公司。

1.4 劑量設(shè)計(jì) 樣品推薦用量為2 次/d，2 片/次，0.53 g/片，因此每人2.12 g/d。成人體質(zhì)量以60 kg 計(jì)，則樣品用量相當(dāng)于0.035 g/ kg·bw。以人體推薦量的5 倍，即每日0.175 g/kg·bw 為低劑量，另設(shè)2 個(gè)劑量組：0.35 g/kg·bw （人體推薦量的10 倍為中劑量）和1.05 g/kg·bw （人體推薦量的30 倍為高劑量）。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（灌胃去離子水），以及假手術(shù)+去離子水組和卵巢切除+去離子水組。

2 功能性試驗(yàn)

2.1 試驗(yàn)方案 雌性SD 大鼠50 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后隨機(jī)分成5組，每組10 只。去勢(shì)手術(shù)安排：假手術(shù)+去離子水組，鼠經(jīng)腹腔注射30 mg/kg·bw 的戊巴比妥鈉溶液麻醉，在嚴(yán)格無菌操作下，腹位固定后于腹中線距陰道口3 ～4 cm 處去毛，分別用碘酒和酒精消毒，待稍干后切開皮膚和腹肌約2 ～3 cm，腹肌和皮膚分層縫合后，再次消毒。最后經(jīng)后肢肌肉注射2 萬U 青霉素；卵巢切除組+去離子水組和雷允上牌固葆片三個(gè)劑量組，麻醉方法同上，在嚴(yán)格無菌操作下，腹位固定后于腹中線距陰道口3 ～4 cm 處去毛，分別用碘酒和酒精消毒，待稍干后切開皮膚和腹肌約2 ～3 cm，切口視野可見白色脂肪，撥開脂肪層找到子宮后，輕輕將一側(cè)子宮角拉出，在其末端可見被脂肪團(tuán)包裹的卵巢。分離脂肪團(tuán)，便可見粉紅色或黃紅色的卵巢，以止血鉗夾住卵巢，然后將卵巢下輸卵管（包括脂肪）用絲線結(jié)扎，剪除卵巢（檢查是否完全剪除），順勢(shì)將子宮角送回腹腔中，同法剪除另側(cè)卵巢，腹肌和皮膚分層縫合后，再次消毒。最后經(jīng)后肢肌肉注射2 萬U青霉素。為保證手術(shù)成功，大鼠摘除卵巢后5 d，進(jìn)行陰道涂片檢查（用滴管吸取少量生理鹽水，輕輕插入陰道1 ～2 cm，沖洗數(shù)次后吸出，涂于玻片上，鏡下觀察），1 次/d，連續(xù)7 d，以檢查大鼠卵巢是否完全摘除；如涂片呈動(dòng)情反應(yīng)（鏡下見大量半透明、扁平的表皮細(xì)胞），表明動(dòng)物卵巢切除不完全，應(yīng)棄去不用[13-14]。

切除大鼠雙側(cè)卵巢7 d 后，按照1.4 劑量設(shè)計(jì)，卵巢切除三個(gè)劑量組（灌胃液的配制：分別取鹿茸補(bǔ)骨片1.75 g，3.5 g，10.5 g，加去離子水定容至100 mL，配制成0.175 g/kg·bw，0.35 g/kg·bw，1.05 g/kg·bw的灌胃液）；經(jīng)口給予假手術(shù)+去離子水組和卵巢切除+去離子水組動(dòng)物等容積的去離子水。所有動(dòng)物灌胃劑量均為10 mL/kg·bw，1 次/d，連續(xù)灌胃90 d，每周稱體質(zhì)量并按體質(zhì)量調(diào)整灌胃量。

2.2 骨密度測(cè)定 將待測(cè)股骨放置測(cè)量臺(tái)上，與骨密度儀探測(cè)頭移動(dòng)方向垂直，移動(dòng)待測(cè)股骨，令其待測(cè)點(diǎn)標(biāo)記線與探測(cè)頭移動(dòng)軌跡與測(cè)量臺(tái)上的垂直投影重合。開始測(cè)量，每個(gè)點(diǎn)測(cè)量2 次，2 次測(cè)量誤差不大于10%。將2 次結(jié)果取平均值[15-16]。

2.3 骨鈣含量測(cè)定 取大鼠一側(cè)股骨，在105 ℃烘箱中烘干至恒重后，精密稱重和精密測(cè)量長度，記錄數(shù)值。將股骨研成粉末，精密稱取適量（0.300 ～1.000 g），置于150 mL 三角瓶中，上蓋小漏斗，加入混酸（硝酸：高氯酸= 4：1）15 ～20 mL，在電熱板上加熱消化直至冒白煙并透明無色。消化液透明無色后加入少量去離子水，煮沸，除去剩余的酸，重復(fù)2 次，最后消化液體積不超過1 mL?？瞻讓?duì)照為相同體積的混酸，按照樣品處理相同方法消化制得。以原子吸收法測(cè)定骨鈣含量[17]。

2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)＜F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F≥F0.05，P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或是方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或是方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若是變量轉(zhuǎn)換后仍未到達(dá)正態(tài)或是方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.5 結(jié)果判定 本產(chǎn)品屬不含鈣的產(chǎn)品，卵巢切除+去離子水組（模型對(duì)照組）骨鈣含量或骨密度顯著低于假手術(shù)組（空白對(duì)照組），表明造成大鼠骨密度低下模型；卵巢切除+受試物組的骨鈣含量和骨密度較卵巢切除+去離子水組顯著增加，而其他指標(biāo)（體質(zhì)量除外）不顯著低于卵巢切除+去離子水組，可判定受試物具有增加骨密度功能作用。

3 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

選用SD 大鼠和ICR 小鼠各20 只，雌雄各半，體質(zhì)量分別為180 ～220 g 和18 ～22 g。大、小鼠購買后在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境5 d，采用最大耐受量試驗(yàn)方法，禁食16 h后24 h內(nèi)經(jīng)口灌胃二次[18]。取鹿茸補(bǔ)骨片50 g，溶于去離子水中并定容至100 mL 大、小鼠的灌胃容積均為20 mL/kg·bw，灌胃劑量均為20.0 g/kg·bw（相當(dāng)于推薦劑量的666.7 倍）。觀察大、小鼠的中毒表現(xiàn)和死亡時(shí)間，觀察時(shí)間為14 d。

4 結(jié)果

4.1 受試樣品對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響 由表1可見，初始體質(zhì)量、給樣前（去勢(shì)手術(shù)后）各組體質(zhì)量無顯著性差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)從第1 周開始卵巢切除+去離子水組體質(zhì)量顯著高于假手術(shù)+去離子水組（第1 周P＜0.05，第2 周以后P＜0.01），90 d喂養(yǎng)中給予受試物各劑量組體質(zhì)量顯著高于假手術(shù)+去離子水組（P＜0.01），而與卵巢切除+去離子水組無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 受試樣品對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響（n = 10） g

4.2 鹿茸補(bǔ)骨片對(duì)骨鈣含量的影響 由表2可見，給予受試物90 d 后，卵巢切除+去離子水組骨鈣含量和總鈣量顯著低于假手術(shù)+去離子水組（P＜0.01），各組與卵巢切除+去離子水組相比，股骨重量略低，但沒有顯著性差異（P＞0.05），造模成功；受試物組骨鈣含量和總鈣量有不同程度增高，其中，中、高劑量組（即卵巢切除+ 0.35組和卵巢切除+1.05組）骨鈣含量和總鈣量均顯著高于卵巢切除+去離子水組（P＜0.01）。

表2 去卵巢大鼠股骨重量和骨鈣含量變化（n = 10）

4.3 鹿茸補(bǔ)骨片對(duì)大鼠骨密度的影響 由表3可見，給予受試物90 d 后，卵巢切除+去離子水組骨密度顯著低于假手術(shù)+去離子水組（P＜0.01），中、高劑量組股骨中心骨密度和股骨遠(yuǎn)心端骨密度均顯著高于卵巢切除+去離子水組（P＜0.01）。

4.4 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果 見表4、5、6。

5 討論

鹿茸補(bǔ)骨片由四味中藥配伍，相得益彰，共奏補(bǔ)血填精，固腎健骨之功效[19-20]，適用于骨痿（骨質(zhì)疏松）以五臟虛衰，腎枯髓竭證，以周身骨痛，腰背酸軟疼痛，常易抽筋、多汗，下肢痿軟無力，不能持重為主要臨床表現(xiàn)者[21-22]。綜合試驗(yàn)結(jié)果分析可知，給予鹿茸補(bǔ)骨片90 d 后，中、高劑量組均能顯著提高去卵巢大鼠骨密度，低、中、高劑量組均能顯著提高去卵巢大鼠骨鈣含量，其他指標(biāo)如體質(zhì)量、股骨長度、股骨重量等均不顯著低于模型組。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003年版判定標(biāo)準(zhǔn)，判定鹿茸補(bǔ)骨片具有增加骨密度功能作用。在14 d的觀察期間內(nèi)，兩性別大、小鼠一般狀態(tài)良好，未出現(xiàn)任何中毒癥狀，無動(dòng)物死亡。根據(jù)試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的劑量，觀察到的結(jié)果及大、小鼠急性毒性判定標(biāo)準(zhǔn)，可以認(rèn)為鹿茸補(bǔ)骨片大、小鼠經(jīng)口最大耐受量大于20.0 g/kg·bw，且屬無毒級(jí)，也可作為其他毒理學(xué)試驗(yàn)劑量的依據(jù)。

表3 受試樣品對(duì)大鼠股骨長度和骨密度的影響（± s，n = 10） g/cm2

表3 受試樣品對(duì)大鼠股骨長度和骨密度的影響（± s，n = 10） g/cm2

注：與假手術(shù)+去離子水組比較，## P ＜0.01；與卵巢切除+去離子水組比較，△△P ＜0.01

股骨遠(yuǎn)心端骨密度（g/cm2）假手術(shù)+去離子水 0.210±0.012△△ 0.254±0.030△△卵巢切除+去離子水 0.189±0.020## 0.200±0.018##卵巢切除+ 0.175 g/kg·bw 0.203±0.012 0.214±0.020##卵巢切除+ 0.35 g/kg·bw 0.209±0.016△△ 0.218±0.019##△△卵巢切除+ 1.05 g/kg·bw 0.215±0.018** 0.226±0.029##**組 別 股骨中心骨密度（g/cm2）

表4 鹿茸補(bǔ)骨片大、小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)體質(zhì)量（± s ，n = 10） g

表4 鹿茸補(bǔ)骨片大、小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)體質(zhì)量（± s ，n = 10） g

動(dòng)物 性別 劑量/（g/kg·bw） 初始體質(zhì)量 1 周末體質(zhì)量 2 周末體質(zhì)量小鼠 雄 20.0 20.3±1.4 25.8±1.4 30.3±2.6雌20.0 images/BZ_125_794_1287_798_1287.png 20.2±1.3 25.0±1.5 29.0±1.4大鼠 雄 20.0 201.4±11.2 241.4±7.7 293.0±8.8雌20.0 199.8±14.1 235.1±6.0 280.5±8.8

表5 鹿茸補(bǔ)骨片大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果（n = 10） g/kg·bw

表6 鹿茸補(bǔ)骨片小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果（n = 10） g/kg·bw