基于MALDI-TOF MS微生物檢測(cè)的一次性紙基靶板開發(fā)

曾 真，喻佳俊，劉 平，黃正旭，高 偉，李 梅，周 振，李 磊*

(1.暨南大學(xué) 質(zhì)譜儀器與大氣環(huán)境研究所，廣東 廣州 510632；2.廣州禾信康源醫(yī)療科技有限公司，廣東 廣州 510530)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種生物質(zhì)譜[1]，該技術(shù)通過(guò)檢測(cè)微生物的蛋白質(zhì)指紋圖譜來(lái)鑒定微生物[2-5]，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、自動(dòng)化及高通量等特點(diǎn)[6]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、生物防御、環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品質(zhì)量控制等領(lǐng)域。

靶板用來(lái)承載待檢測(cè)的樣品和基質(zhì)，是MALDI-TOF MS的重要組成部分。靶板的使用材料以及制作工藝對(duì)質(zhì)譜儀的性能有很大影響，目前市面上所用的靶板主要為可重復(fù)使用的不銹鋼靶板。臨床診斷對(duì)醫(yī)療器械和用具的清潔程度有很高的要求[7]，例如尿檢、血檢等使用的都是一次性可丟棄的塑料管，非一次性的用具在使用之前也有一系列的消毒規(guī)范[8]。一方面要避免殘留物影響檢測(cè)結(jié)果，另一方面也要給患者和醫(yī)護(hù)人員提供安全良好的醫(yī)療環(huán)境，避免病源的交叉感染[9]。不銹鋼靶板最主要的缺點(diǎn)就是每次使用完均需使用丙酮等有機(jī)溶液清洗[10]，過(guò)程繁瑣且易有殘留，不僅耗費(fèi)大量時(shí)間，稍有不慎還會(huì)影響診斷的結(jié)果。可拋棄的一次性靶板是臨床應(yīng)用的發(fā)展方向，Schurenberg 等[11]提出的一種一次性塑料靶板獲得了較為廣泛的應(yīng)用，但塑料材料難降解，使用完后仍不易處理，若將帶有致病菌的塑料靶板隨意丟棄，會(huì)對(duì)土壤或水環(huán)境造成一定的污染[12]。近年來(lái)，基于紙開展的科學(xué)研究工作越來(lái)越多，Whitesides等[13]首次提出將紙作為微流控技術(shù)芯片，代替常規(guī)的玻璃、硅、石英、高聚物等材料，使微流控芯片的成本降低并可作為一次性分析器件使用。Wang等[14]第一次將紙應(yīng)用于質(zhì)譜領(lǐng)域作為電噴霧電離源的基質(zhì)和載體，被稱為紙噴霧電離技術(shù)。該技術(shù)具有快速、低廉、高效等特點(diǎn)，已被用于血樣、尿樣、食品、生物組織樣品、藻類等樣品的快速分析檢測(cè)[15-18]。鑒于此，本團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種用于MALDI-TOF MS的紙基靶板。該靶板相比于普通鋼靶板的優(yōu)點(diǎn)在于：(1)成本低且便于攜帶和運(yùn)輸；(2)使用完后可以直接更換，節(jié)省了清洗所耗費(fèi)的時(shí)間；(3)一次性使用，可以避免之前的殘留物影響檢測(cè)結(jié)果；(4)由于液體在紙上具有擴(kuò)散性，只需少量的樣品就可以擴(kuò)散整個(gè)靶點(diǎn)，使樣品的消耗量更少。與普通的塑料一次性靶板相比：(1)紙質(zhì)靶板制作工藝更加簡(jiǎn)單，在實(shí)驗(yàn)室即可自行制備，隨用隨制，成本低廉；(2)用后焚毀不會(huì)對(duì)土壤或水環(huán)境造成污染。本文通過(guò)對(duì)比同種樣品在紙基靶板與不銹鋼靶板上檢測(cè)時(shí)譜圖的分辨率、靈敏度、重現(xiàn)性，證實(shí)了紙基靶板能替代常用的鋼靶板；實(shí)際細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果表明，該紙基靶板具有用于臨床微生物檢測(cè)的潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

緩激肽1-7(B4181,Bradykinin Fragment 1-7,756.40 Da)、血管緊張素Ⅱ(A8846,Angiotensin Ⅱ,1 045.54 Da)、促腎上腺皮質(zhì)激素肽段18-39(A8346,ACTH Fragment 18-39,2 464.20 Da)、胰島素(I6279,Insulint,5 729.61 Da)、細(xì)胞色素C(C8857,Cytochrome C,12 361.96 Da)、肌紅蛋白(A8971,Apomyoglobin,16 951.30 Da)、牛血清白蛋白(A8471,BSA,66 429 Da)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(C8982,CHCA)、0.1%三氟乙酸(T3443,TFA)、乙腈(A8596,ACN)，均購(gòu)于Sigma Aldrich公司。

混合多肽校準(zhǔn)品Peptide Calibration StandardI(#206195,BrukerDaltonics)和混合蛋白校準(zhǔn)品Protein Calibration StandardI(#206355,BrukerDaltonics)均來(lái)源于德國(guó)布魯克道爾頓公司；大腸桿菌由北京鑫匯普瑞科技發(fā)展有限公司惠贈(zèng)。所用實(shí)驗(yàn)純凈水均由Milli-Q系統(tǒng)產(chǎn)生。

基質(zhì)CHCA利用乙腈-三氟乙酸-水(50∶2.5∶47.5,體積比)混合溶劑溶解，配成CHCA的飽和溶液。標(biāo)準(zhǔn)蛋白、多肽樣品根據(jù)所需濃度利用0.1%三氟乙酸溶液配制而成。處理微生物樣品時(shí)，從培養(yǎng)基上挑選3～4個(gè)單菌落，加入300 μL的滅菌純水和700 μL的無(wú)水乙醇混勻，離心后棄去上清液，再次離心，去除殘余的上清液，加入70%甲酸水溶液-乙腈(1∶1,體積比)20 μL，充分混勻后離心，取上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有樣品均采用覆蓋點(diǎn)樣法，即每個(gè)點(diǎn)位先點(diǎn)1.0 μL樣品，干燥后再覆蓋1.0 μL基質(zhì)，自然風(fēng)干后上機(jī)待用。

1.2 紙靶板的制作

紙基材質(zhì)因吸水性、孔徑、纖維粗細(xì)等參數(shù)不同而具有不同的特性。本實(shí)驗(yàn)選擇Whatman No.1濾紙[19]作為制作紙基靶板的材料。此濾紙具有空隙均勻、顆粒保留效果良好等優(yōu)點(diǎn)，且溶劑的作用會(huì)使纖維素膨脹從而減小毛細(xì)管作用力，降低甚至阻止液體的滲透和流動(dòng)，有利于樣品的聚集。

圖1 紙基靶板實(shí)物圖Fig.1 The picture of the real paper-based plate

紙基靶板的制作采用手繪蠟印技術(shù)[20-22]。具體步驟如下：(1)模具設(shè)計(jì)：根據(jù)所需靶點(diǎn)的尺寸及數(shù)量利用不飽和聚酯樹脂制作熱固性塑料模具，模具上圓點(diǎn)的尺寸和數(shù)量均可由用戶根據(jù)需求自行設(shè)計(jì)。本實(shí)驗(yàn)儀器采用的模具點(diǎn)尺寸與標(biāo)準(zhǔn)96孔靶板一致，孔橫縱間距均為4 mm，孔直徑為3 mm，模具中圓點(diǎn)部分無(wú)孔緊實(shí)，圓點(diǎn)周邊呈網(wǎng)紗質(zhì)地，以使蠟?zāi)軡B透。(2)壓模與涂蠟：將上述模具覆蓋在濾紙上，用蠟筆將整個(gè)模具描滿，使模具和濾紙成一整體。(3)壓實(shí)：用不銹鋼片來(lái)回壓實(shí)蠟筆描摹區(qū)域，使蠟體穩(wěn)定地附著在濾紙表面。需特別注意，在來(lái)回壓實(shí)的過(guò)程中，需用力重復(fù)壓實(shí)動(dòng)作10～20次，才能使蠟體較好地附著在濾紙表面。(4)熱印：將粘連的模具和濾紙整體放置在高溫爐(大約150 ℃)上加熱2～3 s，使每個(gè)孔位周邊區(qū)域的蠟滲透至濾紙上，在濾紙上形成孔位親水和外周疏水的靶板(圖1)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

利用蛋白及多肽樣品對(duì)比紙基靶板與鋼靶板的分辨率和靈敏度，并測(cè)試紙基靶板的重現(xiàn)性，從而驗(yàn)證紙基靶板使用的可行性。采用10 pmol/μL的激緩肽、血管緊張素Ⅱ、促腎上腺激素肽段18-39、胰島素、細(xì)胞色素C、肌紅蛋白、牛血清白蛋白，對(duì)比考察紙基靶板與鋼靶板在同種實(shí)驗(yàn)條件下質(zhì)譜儀的分辨率情況。分辨率均為5次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的平均值。靈敏度則利用10 pmol/μL、1 pmol/μL、500 fmol/μL的BSA進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算各濃度下BSA 3個(gè)離子峰的信噪比(取5次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值)，BSA的3個(gè)離子峰包括母體離子峰(m/z66 430)、雙電荷離子峰(m/z33 216)、三電荷離子峰(m/z22 144)。再利用Peptide Calibration StandardI(離子峰質(zhì)量分布在1 000～4 000 Da之間)檢驗(yàn)紙基靶板的重現(xiàn)性，Peptide Calibration StandardI包含血管緊張素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ,1 295.68 Da)、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,1 045.54 Da)、物質(zhì)P(Substance P,1 346.74 Da)、鈴蟾肽(Bombesin,1 618.82 Da)、促腎上腺激素1-17(ACTH clip 1-17,2 092.09 Da)、促腎上腺激素18-39(ACTH Clip 18-39,2 464.20 Da)、生長(zhǎng)激素抑制素28(Somatostatin 28,3 146.47 Da)7種多肽。最后將紙基靶板實(shí)際應(yīng)用于大腸桿菌的鑒定。

MALDI-TOF MS為實(shí)驗(yàn)室自制的直線式基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀[23]。所有譜圖均在正離子模式下得到，離子加速電壓為22 kV，所用激光波長(zhǎng)為343 nm，頻率為20 Hz，能量為出峰的臨界值。每張譜圖為激光出射200次的疊加圖譜。使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物Protein Calibration StandardI和標(biāo)準(zhǔn)多肽混合物Peptide Calibration StandardI校準(zhǔn)質(zhì)譜儀。微生物鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)由北京鑫匯普瑞科技發(fā)展有限公司提供。

圖2 紙基靶板(A)和不銹鋼靶板(B)上BSA(10 pmol/μL)與CHCA基質(zhì)的共結(jié)晶圖Fig.2 Crystal of BSA(10 pmol/μL) and CHCA matrix on paper-based plate(A) and stainless steel plate(B)

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)晶情況

圖2A和圖2B分別為紙基靶和鋼靶板上1 μL牛血清白蛋白(10 pmol/μL)與1 μL CHCA基質(zhì)的共結(jié)晶圖。由圖可看出紙基靶板上由于樣品與基質(zhì)的結(jié)晶顆粒被紙纖維阻擋不能輕易流動(dòng)，故結(jié)晶范圍局限在1 mm內(nèi)，類似于AnchorChip的靶板效果[24]，可以使儀器具有較高的靈敏度及信號(hào)重現(xiàn)性。鋼靶板上結(jié)晶體稀疏的分布在靶圈內(nèi)，沒(méi)有聚集效果，檢測(cè)時(shí)會(huì)由于分布不均勻，導(dǎo)致不同區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度相差較大，重現(xiàn)性較差。

圖3 分辨率比較圖Fig.3 Comparison of the resolutionA.peptides,B.proteins,C.BSA

2.2 質(zhì)量分辨率的對(duì)比

質(zhì)量分辨率(以下簡(jiǎn)稱分辨率)對(duì)比情況如圖3所示。在700～3 000 Da范圍內(nèi),鋼靶板所得的結(jié)果優(yōu)于紙基靶板(圖3A)，鋼靶板分辨率最高為4 309(m/z2 465)，最低為3 155(m/z757)，紙基靶板分辨率最高為4 128(m/z2 465)，最低為2 484(m/z757)；在3 000～20 000 Da范圍內(nèi)，鋼靶板在m/z5 731和m/z12 362的分辨率稍高于紙基靶板，但紙基靶板在m/z8 477和16 952處峰的分辨率優(yōu)于鋼靶板，紙靶板和鋼靶板的最低分辨率同時(shí)在m/z8 477處出現(xiàn)，分別為746和413，最高分辨率同時(shí)在m/z12 362處出現(xiàn)，分別為1 095和1 501(圖3B)；20 000～60 000 Da范圍內(nèi)，紙基靶板上m/z22 144、33 216和66 430 3個(gè)位置峰的分辨率全部都優(yōu)于鋼靶板，且鋼靶板上3個(gè)峰分辨率的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值要大于紙基靶板，可以看出鋼靶板上峰分辨率的波動(dòng)比紙基靶板大(圖3C)。導(dǎo)致紙基靶板與鋼靶板對(duì)同一樣品分辨率不同的主要原因是同種樣品在不同的靶板上結(jié)晶情況有差異。當(dāng)樣品形成的結(jié)晶小且薄時(shí)，樣品離子的初始位置分散減小，縮短了分子量相同的離子到達(dá)離子檢測(cè)器的時(shí)間差，此時(shí)可獲得較高的分辨率；但當(dāng)樣品結(jié)晶堆積較厚時(shí)，樣品離子的初始位置分散變大，導(dǎo)致分子量相同的離子到達(dá)離子檢測(cè)器的時(shí)間差變大，分辨率變低。但總體上，使用紙基靶板能獲得與鋼靶板差不多的分辨率。

2.3 靈敏度的對(duì)比

圖4展示的是10 pmol/μL、1 pmol/μL、500 fmol/μL的BSA分別在紙基靶板和鋼靶板上的譜圖。當(dāng)樣品濃度為500 fmol/μL時(shí)，BSA的3個(gè)峰全部清晰可見，說(shuō)明兩種靶板對(duì)于BSA的靈敏度均能達(dá)到500 fmol/μL，且紙基靶板上500 fmol/μL BSA在m/z22 144、33 216、66 430位置處峰的信噪比比鋼靶板更高(表1)。這是由于紙基靶板的聚焦效果使得樣品可聚集在小范圍內(nèi)，從而能獲得較高的靈敏度。

2.4 重現(xiàn)性及結(jié)晶均勻性驗(yàn)證

重現(xiàn)性結(jié)果如圖5所示，在紙基靶板上混合多肽Peptide Calibration StandardI 5個(gè)靶點(diǎn)的譜圖均出現(xiàn)了該混合多肽包含的全部離子峰，表明紙基靶板具有較高的重現(xiàn)性，因此紙基靶板的使用不會(huì)對(duì)質(zhì)譜儀的重現(xiàn)性產(chǎn)生影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證樣品與基質(zhì)結(jié)晶在紙基靶板上的均勻性，在激光能量不變的情況下，轟擊ACTH樣品在同一個(gè)靶點(diǎn)上的不同位置，每個(gè)位置激光以20 Hz的頻率出射80次。圖6即為5個(gè)位置的ACTH強(qiáng)度變化，由圖可知ACTH的峰強(qiáng)度依次為438、404、426、479、457 mV，計(jì)算得5個(gè)數(shù)據(jù)間的變異系數(shù)值僅為6%；在相同條件下，ACTH在鋼靶板上譜圖的峰強(qiáng)度分別為1 105、1 054、846、858、928 mV，變異系數(shù)為12%，表明紙基靶板上的樣品結(jié)晶較鋼靶板更為均勻。

表1 10 pmol/μL、1 pmol/μL、500 fmol/μL牛血清白蛋白信噪比Table 1 S/N ratios of 10 pmol/μL,1 pmol/μL，500 fmol/μL BSA

圖5 紙基靶板5個(gè)不同靶點(diǎn)上Peptide Calibration StandardI的譜圖Fig.5 Mass spectra of the five different spots of Peptide Calibration StandardI on paper-based plate

圖6 紙基靶板同一靶點(diǎn)上5個(gè)不同位置獲得的ACTH譜圖的峰信號(hào)強(qiáng)度Fig.6 Signal intensities of the mass spectra of ACTH in five different shots on paper-based plate

圖7 大腸桿菌在紙基靶板上的譜圖Fig.7 Mass spectra of the Escherichia coli on the paper-based plate

2.5 微生物檢測(cè)及質(zhì)量精度驗(yàn)證

圖7為大腸桿菌提取蛋白在紙基靶板上的譜圖，將譜圖中的主要峰與Jones等[25]在文章中所提的大腸桿菌主要峰的理論峰值相比較，結(jié)果如表2所示。除了m/z9 537.9位置處的峰與理論峰值m/z9 535.3偏差為0.3‰外，其余峰值與理論峰值相差均在0.1‰以下。布魯克MALDI Biotyper細(xì)菌鑒定平臺(tái)的性能指標(biāo)規(guī)定質(zhì)量精度(外標(biāo)法)在0.5‰以下即可。分析m/z9 535.3位置處偏差較大的可能原因是：在高質(zhì)量范圍內(nèi)，受分辨率的限制，質(zhì)譜儀不能將準(zhǔn)分子離子峰與其同位素離子峰完全分開，導(dǎo)致準(zhǔn)分子離子峰不是一個(gè)呈正態(tài)分布的曲線，因此無(wú)法確定準(zhǔn)分子離子峰的具體質(zhì)荷比。為解決這一問(wèn)題需利用軟件在原始離子峰的基礎(chǔ)上擬合出一個(gè)正態(tài)分布的曲線，再取其頂點(diǎn)位置的橫坐標(biāo)為峰的質(zhì)荷比。而當(dāng)準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度低于同位素離子峰，且強(qiáng)度最大的同位素離子峰處在準(zhǔn)分子離子峰偏右的位置時(shí)，就會(huì)使擬合的平滑曲線頂點(diǎn)向右偏，導(dǎo)致峰的質(zhì)荷比變大。

表2 紙基靶板上大腸桿菌理論出峰情況與實(shí)際出峰情況對(duì)比Table 2 Comparison of the theoretical and practical peaks of the Escherichia coli

將質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入MicroID微生物鑒定系統(tǒng)，鑒定分值9.2分，結(jié)果為大腸桿菌(9分以上表示高度可信，8分以上表示結(jié)果可信，6～8分表示結(jié)果可參考，6分以下表示無(wú)鑒定結(jié)果或結(jié)果不可信)。初步表明紙基靶板可用于微生物的鑒定。

3 結(jié) 論

本研究提出了一種用于MALDI-TOF MS分析的新型一次性紙基靶板。該靶板相較于普通鋼靶板具有成本低，制作工藝簡(jiǎn)單，能有效避免樣品交叉污染，使用后便于處理，減少環(huán)境污染等特點(diǎn)。通過(guò)在分辨率、靈敏度、重現(xiàn)性等方面與傳統(tǒng)鋼靶板進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在整體性能上紙基靶板與鋼靶板分辨率相當(dāng)，靈敏度可達(dá)到500 fmol/μL(BSA)，且樣品檢測(cè)具有較高的重現(xiàn)性。最后利用紙基靶板以及微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)紙基靶板所得的譜圖與實(shí)際大腸桿菌出峰情況基本一致且鑒定結(jié)果為高度可信。目前，紙基靶板還在初步測(cè)試階段，后續(xù)經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的工藝改進(jìn)有望在臨床微生物的快速診斷等方面發(fā)揮積極的作用。