人體血清中3種脂溶性維生素的液相色譜-串聯質譜分析方法研究

劉海培,姜小梅,韓文念，許舒欣，李 艷，汪 曣，蔣學慧*

(1.天津大學 精密儀器與光電子工程學院，天津 300072；2.天津國科醫工科技發展有限公司，天津 300399)

維生素是維持人體健康所必需的物質，其缺乏或過量均會影響人體代謝平衡。其中，維生素A(VA)、維生素D3(VD3)、維生素E(VE)為脂溶性維生素，具有促進機體生長發育，調節生理機能，增強免疫的作用[1]，可在體內大量貯存，屬于人體內源性代謝物。通過檢測維生素的含量可評估患者體內的營養狀況，目前的測定方法主要有酶免疫法[2]、化學發光免疫法[3]及質譜法等。其中，液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)法[4-5]具有高精確度、高靈敏度和可實時監測的優勢，對于維生素缺乏的臨床判斷、治療管理具有輔助診斷的作用[6-7]。

液相色譜-質譜聯用技術用于內源性代謝物的實際分析時，真實的生物基質(Authentic matrix)中含有的待測物質會影響標準樣品濃度，從而影響定量結果的準確性[8-9]。目前常采用牛血清白蛋白(BSA)等替代基質(Surrogate matrix)[10-11]來模擬生物基質，或采用活性炭吸附等前處理手段從真實生物基質中得到已去除內源性代謝物的剝離基質(Stripped matrix)[12]。然而此方法成本高，且可能破壞除內源性代謝物以外的基質成分或者內源性代謝物去除不完全，影響樣本原有信息，從而導致基質效應問題[13-14]。另外一些新開發的方法無法找到合適的空白基質，給定量分析增加了難度。

本研究利用LC-MS/MS對人體血清中維生素A、維生素D3和維生素E 3種脂溶性維生素進行同時檢測，以混合人血清基質中加入標準品并結合同位素內標法建立標準曲線進行定量，通過對內源性代謝物本底扣除的方法，解決了模擬基質下檢測的標準品與待測基質不匹配的問題，并與BSA模擬基質方法的檢測結果進行對比。所建立的方法適用于人體內源性代謝物的快速準確分析，可滿足臨床對于相關疾病的診斷需求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AX液相色譜儀(島津公司)，API4000三重四極桿質譜儀(AB SCIEX公司)，F138469O離心機(Eppendorf公司)，VORTEX-5旋渦混合器(其林貝爾儀器公司)，96孔氮吹儀(VSD150-1A,無錫沃信儀器制造有限公司)，微量移液器(N32901F、N46632F、P24390G、O47528F,Eppendorf公司)，離心管(3810X,Eppendorf公司)。

甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，Fisher Chemical公司)；正己烷(色譜純,Sigma-Aldrich公司)；牛血清白蛋白(Amresco公司)，蒸餾水(屈臣氏集團有限公司)。

維生素A(100 mg/L)、25-羥基維生素D3干粉試劑以及維生素E(1 000 mg/L)標準品均購于加拿大多倫多研究化學公司，維生素A乙酸酯(VA-D6)、25-羥基維生素D3-D6干粉試劑(VD3-D6)、α-生育酚D6(VE-D6,500 mg/L)內標標準品均購于Medical Isotopes公司。

1.2 實驗條件

色譜條件：色譜柱為Shim-pack GIST-HP C18(2.1 mm×100 mm×3 μm，島津公司)，流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫程序：0～2.0 min，70% B；2.0～5.0 min，70% ～100% B；5.0～5.1 min，100% B；5.1～6.5 min，100%～70%B。流速為0.5 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣量為10 μL。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，多反應監測(MRM)掃描模式，氣簾氣(CUR)壓力 103 kPa，離子化電壓(IS) 5 500 V，溫度(TEM)設為350 ℃，噴霧氣(GS1)壓力 414 kPa，輔助加熱氣(GS2)壓力 448 kPa。3種脂溶性維生素的質譜參數見表1，選取Q1質量數為母離子，Q3質量數為子離子進行定量分析。

表1 3種脂溶性維生素的質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters of three fat-soluble vitamins

*DP:declustering potential;CE:collision energy;CXP:collision cell exit potential;EP:entrance potential

1.3 樣品配制

1.3.1 空白樣品制備取90 μL混合人血清，加入10 μL甲醇和10 μL內標工作液得到空白基質樣品，取牛血清白蛋白(5% BSA)按相同步驟得到空白基質樣品，作為對照。

1.3.2 標準樣品制備稱取標準樣品，采用甲醇逐級稀釋得到標準工作溶液。分別精密吸取90 μL混合人血清和5% BSA，各加入標準工作溶液10 μL，配制各濃度的生物標準曲線樣品，加入10 μL內標工作液以及200 μL甲醇-乙腈(體積比1∶1)作為沉淀劑，渦旋振蕩60 s；再加入600 μL正己烷作為萃取劑，劇烈振蕩120 s；以14 000 g轉速離心5 min，取上層有機層500 μL，室溫下氮氣吹干，加入50%甲醇水溶液100 μL進行復溶，充分混勻30 s后，待LC-MS/MS分析。

1.4 數據處理方法

分別采用混合人血清基質和BSA基質配制已知濃度的標準樣品與未知濃度的待測樣品，在相同實驗條件下依次進行LC-MS/MS檢測，得到每組樣品的信號色譜峰及其對應的內標峰面積。其中，混合人血清基質作為空白基質樣品，平行進樣8組，確定空白背景的穩定性。計算得到混合人血清空白基質樣品的色譜峰與其對應內標的峰面積比值，在混合人血清基質下得到的標準樣品色譜峰與其對應內標峰面積的比值減去空白樣品比值的平均值，即通過本底扣除的方法去除人體內源性代謝物引入的干擾。所得結果與傳統BSA模擬基質樣品的測定結果進行對比，采用同位素內標法分別建立標準曲線，對定量分析結果進行比較。

1.5 方法評價

1.5.1 線性范圍與檢出限將配制的生物標準曲線樣品經前處理后進樣分析，以目標分析物的質量濃度為橫坐標(X)，其峰面積與對應內標峰面積的比值為縱坐標(Y)，建立標準曲線[15]；以3倍信噪比(S/N=3)，且3次測定的相對標準偏差(RSD)小于20%作為各成分的檢出限(LOD)，以S/N=10且RSD小于20%作為各成分的定量下限(LOQ)。

1.5.2 準確度與精密度通過比較混合人血清基質和BSA基質樣品的加標回收率，確定實驗方法的準確性。對待測人血清樣品加入低、高兩個濃度的3種脂溶性維生素標準品，分別帶入混合人血清基質和BSA基質下建立的標準曲線，計算樣品回收率；每天對加標樣品測定1次，連續檢測5 d，通過計算RSD值驗證兩種方法的重現性。

此外，對于混合人血清空白基質樣品做8組平行樣，每個平行樣重復進樣2次求得平均值，批間實驗每組采用不同混合人血清，以去除人員個體間差異的影響，連續檢測5 d。通過計算RSD值確?；旌先搜蹇瞻谆|樣品批內、批間的穩定性。

1.5.3 方法對比對于40組未知濃度樣本，通過采用混合人血清基質和BSA模擬基質的方法分別進行LC-MS/MS檢測，利用兩種方法建立的標準曲線分別計算得到3種待測維生素的濃度，并進行對比和統計學分析。

2 結果與討論

2.1 色譜-質譜條件的優化

考察了有機相溶劑(甲醇、乙腈、甲醇-乙腈混合溶劑)分別與超純水、0.1%甲酸、0.1%氨水組成的流動相體系對于3種脂溶性維生素峰形及分離效果的影響，結果表明，以甲醇和超純水為流動相體系，并在兩相中分別加入0.1%甲酸，可增加分析物的響應強度，且峰形良好。根據3種脂溶性維生素的疏水特性，選擇C18柱，考察了色譜柱溫度(30、35、40、45 ℃)對分離效果和信號強度的影響，最終采用“1.2”的梯度洗脫方式，在40 ℃柱溫下可得到較好的分離效果。

根據目標分析物的電離情況，選用正離子監測模式進行一級質譜分析，確定母離子后再進行二級質譜的子離子掃描分析，選擇強度較高的1個碎片離子作為定量分析的子離子，并對去簇電壓(DP)、碰撞能(CE)以及碰撞室出口電壓(CXP)等參數進行優化。最終確定優化的質譜條件如“1.2”所示，此時檢測信號響應強度高，譜峰峰形良好且穩定。

在優化實驗條件下，得到3種脂溶性維生素在混合人血清基質下的譜峰及其內標峰的色譜圖(見圖1)，其中維生素A、維生素D3、維生素E及對應內標的保留時間分別為3.45、3.33、4.65 min，可在5 min內完成分離檢測，譜峰峰形良好。

2.2 本底穩定性

按照“1.5.2”方法對混合人血清空白基質樣品進行日內、日間精密度的測試，對待測維生素的峰面積及其內標的峰面積進行提取，計算兩者的比值，每天做8組平行樣品，得到3種脂溶性維生素的日內RSD均不大于8.4%；每天采用不同20份混合人血清空白基質進行測定，連續檢測5 d，得到3種脂溶性維生素的日間RSD均在15% 以內，表明混合人血清空白基質樣品穩定，可對混合人血清基質的實際樣品本底進行背景扣除。

2.3 線性范圍、檢出限及定量下限

按照“1.5.1”進行曲線擬合，結果顯示，采用混合人血清經背景扣除后建立的標準曲線與BSA基質建立的標準曲線，對于3種脂溶性維生素的相關系數(r)均在0.996以上，維生素A、維生素D3和維生素E分別在0.05～2 μg/mL、5～200 ng/mL、1～40 μg/mL范圍內具有良好線性。采用混合人血清基質所建方法對維生素A、維生素D3和維生素E的LOD分別為4.2、0.8、67.2 ng/mL，LOQ分別為13.7、2.6、221.9 ng/mL；采用BSA基質所建方法對維生素A、維生素D3和維生素E的LOD分別為5.6、1.1、75.0 ng/mL，LOQ分別為18.7、3.7、250.0 ng/mL。兩種方法對3種脂溶性維生素的標準曲線對比見圖2，結果顯示，兩種方法的擬合效果顯著接近。

圖2 維生素A(A)、維生素D3(B)、維生素E(C)的標準曲線對比Fig.2 Comparison of standard curve of vitamin A(A),vitamin D3(B) and vitamin E(C)BSA matrix;mixed human serum matrix

2.4 加標回收實驗

按照“1.5.2”方法對待測人血清樣品進行加標回收實驗，每個濃度水平重復5次，兩種方法計算得到維生素A、維生素D3和維生素E的回收率為90.7%～112%，RSD均為1.0%～4.5%(見表2)，表明兩種方法均具有較好的準確度和精密度。連續5 d對低、高兩個濃度的加標樣品進行測定，兩種方法下3種脂溶性維生素在低濃度水平的加標回收率偏差均在±20%以內，高濃度水平的加標回收率偏差在±15%以內，滿足方法學評定要求。

表2 維生素A、維生素D3和維生素E的加標回收率及相對標準偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of vitamin A,vitamin D3 and vitamin E

2.5 方法學比較

對40份健康志愿者的血清樣本進行LC-MS/MS測定，分別采用混合人血清空白基質加標和BSA空白基質加標的方法建立標準曲線，樣本年齡在29～86歲，其中16名男性，24名女性。對兩種方法的測定結果進行比較，如圖3所示，經過T檢驗分析，維生素A、維生素D3和維生素E的P值分別為0.92、0.78、0.93(均大于0.7)，說明兩種方法的計算結果無顯著差異。結果表明，40份健康志愿者血清中維生素A、維生素D3和維生素E的質量濃度分別為280～1 000 ng/mL、5～28 ng/mL、5～28 μg/mL，且采用混合人血清基質對實際樣品中3種脂溶性維生素的檢測結果與BSA模擬基質的檢測結果基本重合，進一步驗證了本方法的可行性。

圖3 兩種方法檢測濃度對比Fig.3 Detecting concentration comparison of two methods mixed human serum matrix;BSA matrix

3 結 論

本研究以人體血清中3種脂溶性維生素檢測為例，探討了一種分析人體內源性代謝物的新方法，采用以混合人血清作為空白基質加入標準品及同位素內標物再對內源性物質扣除本底的方法，可以實現標準曲線樣品與實際待測樣品基質匹配，減少基質效應的干擾且更加便捷。通過實驗證明，此方法與采用BSA模擬基質加入標準品及同位素內標物檢測的方法均滿足方法學評定標準，具有良好的準確性與重現性。因此，針對某些內源性化合物無法獲得純凈空白基質，以及由于模擬基質下檢測的標準品與待測樣品基質不匹配引起的基質效應問題，可以采用直接混合人血清扣除本底的方法，實現對人體內源性代謝物的定量分析。研究結果對于臨床分析檢測具有重要意義。