植物乳桿菌CGMCC8198破碎上清液對黑色素生成的抑制作用

張彩姣，俞曉亭，潘麗娟，周 浩，張同存，羅學(xué)剛

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

黑色素是由黑色素細(xì)胞合成的一種生物色素，能夠保護(hù)細(xì)胞DNA，避免皮膚被紫外線灼傷，但其過速增長或分布不均會導(dǎo)致皮膚局部黑色素沉積過度，導(dǎo)致老年斑、雀斑、黑斑病等病癥[1-2]．酪氨酸相關(guān)蛋白(TRPs)家族和小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)是影響黑色素生成最重要的分子，TRPs家族包括酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白 1(TRP-1)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白 2(TRP-2)．TYR是黑色素生成過程中的限速酶，其表達(dá)和活性決定著黑色素生成的速度和數(shù)量；MITF對 TYR、TRP-1和 TRP-2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控至關(guān)重要．目前市場上很大一部分美白劑的機(jī)理都是抑制酪氨酸酶的活性[3]，常用的美白成分有熊果苷、曲酸、維生素 C及其衍生物等[4]．雖然應(yīng)用廣泛，但也存在一些副作用，比如曲酸的細(xì)胞毒性會導(dǎo)致皮炎甚至癌癥[5-6]，維生素 C的穩(wěn)定性差等，致使其應(yīng)用都不是很完美．此外，一些氧化劑如陽光、煙霧中的紫外線(UV)引起的活性氧(ROS)也會導(dǎo)致皮膚黑色素沉積過多[7]．體內(nèi)過量的自由基可引發(fā)疾病和提前衰老[8]，它可以刺激黑色素激活因子如 PGE2和α-MSH的分泌，從而促進(jìn)黑色素合成[9]．一些ROS清除劑或抑制劑可以減少黑色素生成和皮膚色素沉著，例如應(yīng)用還原型谷胱甘肽(GSH)和抗壞血酸衍生物來治療色素沉著過度等問題[10-11]．

大多數(shù)乳酸菌無毒、無害，并且乳酸菌菌體及其代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性[12]．它的抗氧化活性主要是指對超氧陰離子自由基(O-2·)、羥自由基(OH·)和 1，1-二苯基-2-苦味肼基自由基(DPPH)的清除作用及抗脂質(zhì)過氧化性[13-14]．Liu等[15]研究表明人體攝入某些乳酸菌后，不僅可以降低活性氧的累積，而且可以降低O-2·和過氧化氫的濃度．Kullisssr等[16]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)乳酸菌是通過產(chǎn)生 SOD酶和 GSH而具有清除OH·和過氧化氫的能力．一些乳酸菌由于菌株中NADH和NADPH作用，還具有還原活性[17].

植物乳桿菌(L.plantarum)CGMCC8198具有很好的降血脂、降血糖等功效[18-20]，但其在抑制黑色素形成及美容護(hù)膚等領(lǐng)域的作用尚不清楚．本文采用小鼠黑色素瘤細(xì)胞 B16F10為模型，驗證植物乳桿菌(L.plantarum)CGMCC8198其菌體破碎上清液(LAS)對黑色素生成的抑制效果．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

植物乳桿菌(L.plantarum)CGMCC8198、非洲綠猿猴腎成纖維細(xì)胞 COS-7 和 pGL3-Basic載體均為本實驗室保藏，小鼠黑色素瘤細(xì)胞 B16F10購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所．

1.1.2 試劑與儀器

DPPH、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、噻唑藍(lán)(MTT)、曲酸、左旋多巴(L-DOPA)、蘑菇酪氨酸酶和二甲基亞砜(DMSO)，美國 Sigma-Aldrich公司；TYR、TRP-1、TRP-2和MITF的抗體，美國Abcam公司．

Synergy多功能微孔方板檢測儀，美國Biotek公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國 Thermo Forma公司；ECLIPSE TS100-F型倒置顯微鏡，日本Nikon公司；StepOnePlus Real-time PCR儀，美國 ABI公司；Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)，美國 Li-cor Biosciences公司．

1.2 樣品制備

-80℃保藏的植物乳桿菌以 1%的接種量接入10mL MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至108mL-1．連續(xù)活化 3代后，將植物乳桿菌CGMCC8198的菌液于 4℃、12000r/min離心20min，棄上清液．將得到的菌體用 PBS洗 2次，重復(fù)離心，最終用與原始培養(yǎng)基等體積的 PBS將菌體重懸進(jìn)行超聲破碎．超聲條件：振幅 300，超聲 3s停4s，超聲時間 30min．菌體破碎上清液(LAS)用0.22μm針式過濾器過濾，-20℃冰箱保存．

1.3 抗氧化能力測定

ABTS工作液的配制：稱取ABTS粉末38.4mg，用 PBS定容至 10mL，得 7mmol/L溶液；稱取過硫酸鉀37.8mg，用1mL去離子水溶解，得140mmol/L溶液；將 10mL 7mmol/L ABTS溶液和 176μL 140mmol/L過硫酸鉀溶液混合，在室溫、避光條件下靜置過夜，形成 ABTS+儲備液．使用前用 PBS稀釋成工作液，要求其在 734nm 下的吸光度為 0.7±0.02．

DPPH工作液的配制：稱取 DPPH粉末3.944mg，用甲醇溶解并定容至20mL，DPPH濃度為0.5mmol/L，4℃避光保存．使用前用甲醇稀釋成工作液，反應(yīng)物在514nm下測定吸光度．

ABTS清除實驗：取不同濃度的 LAS樣品100μL，加入到 100μL ABTS工作液中，混勻，37℃避光孵育30min．以PBS為空白對照，在734nm下測定吸光度(A)．以曲酸作為陽性對照組，ABTS清除率按照式(1)計算．

DPPH清除實驗：取不同濃度的 LAS樣品和甲醇各100μL，分別加入到100μL DPPH工作液中，混勻，37℃避光孵育 30min，以甲醇為空白對照(A0)，在514nm下測定LAS樣品的吸光度(A1)．取不同濃度的 LAS樣品 100μL，加入到 100μL 甲醇中混勻，37℃避光孵育 30min，在 514nm 下測定吸光度(A2)．以曲酸作為陽性對照組，DPPH 清除率按照式(2)計算．

1.4 黑色素含量的檢測與細(xì)胞活力的測定

小鼠黑色素瘤細(xì)胞 B16F10和非洲綠猿猴腎成纖維細(xì)胞 COS-7分別用 DMEM-HG培養(yǎng)基和 F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入體積分?jǐn)?shù)為 10%的胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液(100×)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)．

黑色素含量的檢測：將對數(shù)生長期的小鼠黑色素瘤 B16F10細(xì)胞接種于 6孔板，用 5%、10%和 20%的菌體破碎上清液(LAS)處理 B16F10細(xì)胞 48h，觀察培養(yǎng)基顏色變化．用 NaOH裂解法檢測細(xì)胞內(nèi)黑色素含量，每孔加入 1mol/L的 NaOH溶液 500μL，65℃裂解 30min，用移液器將細(xì)胞液吹勻，加入到96孔板中，每孔 100μL，用酶標(biāo)儀測定 490nm 下吸光度．

細(xì)胞活力的測定：采用MTT法測細(xì)胞活力. LAS體積分?jǐn)?shù)為 0%、5%、10%、20%，800μmol/L曲酸作為陽性對照，將細(xì)胞與 LAS樣品孵育 48h后，棄掉培養(yǎng)基，用 5mg/mL的 MTT溶液代替，再培養(yǎng) 4h.去除 MTT溶液，每孔加入 100μL DMSO，采用多功能微孔方板檢測儀測定其在490nm下的吸光度.

1.5 酪氨酸酶活性的檢測

1.5.1 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性檢測

取對數(shù)生長期的小鼠黑色素瘤 B16F10細(xì)胞接種于 6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入含有不同體積分?jǐn)?shù)(0%、5%、10%、20%)LAS的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h．用含有1% Triton X-100的PBS溶液裂解細(xì)胞，與 10mmol/L 的 L-DOPA于37℃避光反應(yīng) 30min，用酶標(biāo)儀在 490nm下測定吸光度．

1.5.2 細(xì)胞外蘑菇酪氨酸酶活性檢測

用蘑菇酪氨酸酶檢測了LAS是否對其有抑制作用，檢測方法參照文獻(xiàn)[21]進(jìn)行了一些改動．向96孔板中每孔加入 40μL 10mmol/L的左旋多巴、40μL 125單位的蘑菇酪氨酸酶、80μL PBS和 40μL不同濃度的LAS樣品混合均勻，曲酸作為陽性對照，滅菌水作為陰性對照，37℃避光孵育10min，490nm下測定吸光度．

1.6 酪氨酸酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

1.6.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

使用 Trizol試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA，并使用 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄． PCR條件：95℃變性30s，54℃退火45s，72℃延伸30s，共28個循環(huán)．反應(yīng)結(jié)束分別取6μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳．β-actin(199bp)上游引物 5'-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3'，下游引物 5'-GAAGGTGGACAGTGAGGC-3'，退火溫度 56℃；TYR(373bp)上游引物 5'-ACACCTGAGGGACCA CTAT-3'，下游引物 5'-CATTGGCTTCTGGGTAAA CT-3'，退火溫度 54℃；TRP-1(264bp)上游引物 5'-GCCACAAGGAGGTTAGAAGACA-3'，下游引物 5'-CCAGTAAGGAAGGGAGAAAGAG-3'，退火溫度58℃；TRP-2(360bp)上游引物 5'-AGAAGTTTGACAG CCCTCC-3'，下游引物 5'-CAAGTTGCTCTGCGGT TAG-3'，退火溫度 56℃；MITF(162bp)上游引物 5'-AACGGGAACAGCAACGAGC-3'，下游引物 5'-TC ACCAGATCAGGCGAGCA-3'，退火溫度54℃．

1.6.2 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)

取對數(shù)生長期的黑色素瘤B16細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入含有不同體積分?jǐn)?shù)(0%、5%、10%、20%)LAS的培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h．用Bestar SybGreen qPCR Mastermix進(jìn)行擴(kuò)增：95℃ 2min；95℃ 10s，60℃ 30s，72℃30s，40個循環(huán)．熔解曲線：95℃ 1min，55℃1min，95℃ 10s．

1.6.3 免疫印跡實驗(Western blot)

棄掉細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，PBS沖洗 2～3次，每孔加入 300μL的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，再用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，收集在 EP管中，100℃煮沸 15min；取 40μL樣品進(jìn)行 SDS-PAGE電泳(5%濃縮膠，電壓 80V；12%分離膠，電壓120V，電泳時間 2～3h)，電轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，經(jīng)水沖洗后用 5%脫脂奶粉封閉 1h，然后加入兔抗 TYR、TRP-1、TRP-2、MITF 一抗抗體，TYR 和MITF稀釋1000倍，TRP-1 和TRP-2稀釋5000倍；4℃孵育過夜．用 PBS洗滌 3次，每 5min 換液 1次；加入稀釋1000倍的TRITC標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育 1h，Odyssey遠(yuǎn)紅外成像系統(tǒng)分析．

1.7 熒光素酶活性檢測

在 COS-7細(xì)胞中應(yīng)用熒光素酶活性檢測 LAS對pGL3-TYR和pGL3-MITF質(zhì)粒的抑制作用．用含有TYR和MITF啟動子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，4h后將培養(yǎng)基換為含有不同濃度 LAS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，利用luci裂解液裂解細(xì)胞，與luci底物反應(yīng)，在多功能微孔檢測儀上檢測．

1.8 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)使用 SPSS V13.0軟件處理；各組實驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示．組間統(tǒng)計學(xué)差異顯著性比較采用t檢驗，*P＜0.05表示統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異，**P＜0.01表示統(tǒng)計學(xué)上有極顯著性差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 LAS的抗氧化作用

LAS的抗氧化作用如圖 1所示．LAS對 ABTS和 DPPH的清除能力隨著加藥量的增加而增強(qiáng)．100%的LAS對ABTS的相對清除率為82.65%，對 DPPH 的相對清除率為 44.30%，結(jié)果表明：LAS對自由基有一定的清除作用，尤其是對 ABTS的自由基清除能力很強(qiáng)．曲酸對 ABTS和 DPPH自由基都有明顯的清除作用，尤其是對 ABTS的作用更加明顯．因此，以曲酸為對照，說明以該抗氧化體系檢測LAS的抗氧化作用的結(jié)果合理．

圖1 LAS的抗氧化作用Fig. 1 Antioxidant effect of LAS

2.2 LAS對小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10的影響

LAS對 B16F10細(xì)胞活力和黑色素生成的影響如圖2所示．

圖2 LAS對B16F10細(xì)胞活力和黑色素生成的影響Fig. 2 Effects of LAS on B16F10 cell viability and melanin production

由圖 2(a)可知，20%的 LAS對細(xì)胞內(nèi)黑色素的抑制效果接近于陽性對照曲酸的，說明 LAS有一定的黑色素抑制作用．同時，在用NaOH裂解法檢測細(xì)胞內(nèi)黑色素之前，將加不同體積分?jǐn)?shù) LAS培養(yǎng)了48h的細(xì)胞培養(yǎng)基收集于 EP管中，對細(xì)胞培養(yǎng)基顏色的觀察結(jié)果如圖2(b)所示．從培養(yǎng)基顏色來看，隨著加藥濃度的增加，培養(yǎng)基顏色逐漸變淺．與對照組相比，20%加藥組培養(yǎng)基顏色明顯變淺，說明細(xì)胞分泌的黑色素明顯減少，LAS對黑色素生成有一定的抑制作用．由圖 2(c)可知，隨著加藥量增加，細(xì)胞存活率有所降低；當(dāng)加藥量為 20%，細(xì)胞的存活率為94.13%，說明細(xì)胞生長情況良好，加藥不會對細(xì)胞數(shù)量造成嚴(yán)重影響．陽性對照曲酸的加藥量為800μmol/L，此濃度下細(xì)胞的存活率為 78.93%，雖然細(xì)胞有所死亡，但這個濃度的細(xì)胞存活率不會對后續(xù)實驗造成嚴(yán)重影響．

2.3 LAS對酪氨酸酶活性的影響

LAS對酪氨酸酶活性的影響如圖 3所示．LAS給藥后明顯抑制 B16F10細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性，并且隨著LAS給藥濃度的增加而降低，當(dāng)LAS的加藥量為 20%時，細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的抑制率為 39.95%(圖 3(a))．

圖3 LAS對酪氨酸酶活性的影響Fig. 3 Effect of LAS on tyrosinase activity

LAS對細(xì)胞外酪氨酸酶活性的影響如圖 3(b)所示，隨著LAS加藥劑量的增加，蘑菇酪氨酸酶的活性并沒有變化，LAS并不能抑制蘑菇酪氨酸酶的活性．為了排除實驗過程中一些試劑等外部因素的干擾，同時也用曲酸檢測了對蘑菇酪氨酸酶活性的影響，結(jié)果如圖 3(c)所示．曲酸能顯著抑制蘑菇酪氨酸酶活性，100μmol/mL的曲酸能抑制 90.99%的蘑菇酪氨酸酶活性．由圖 3(b)和圖 3(c)可以得出結(jié)論，LAS并不能抑制酪氨酸酶自身的活性．綜上說明LAS影響黑色素的生成并不是通過抑制酪氨酸酶自身的活性．

2.4 LAS對酪氨酸酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

LAS對酪氨酸酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響如圖 4所示．在LAS給藥48h后的B16F10細(xì)胞中，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，LAS能明顯降低TYR、TRP-1、TRP-2、MITF的表達(dá)，且隨著LAS給藥量的增加，其抑制作用呈劑量依賴性增強(qiáng)．當(dāng) LAS的加藥量為20%時，對TYR的抑制率為36.90%，對TRP-1的抑制率為 57.72%，對 TRP-2的抑制率為 35.12%，對MITF的抑制率為40.88%(圖4(a))．

LAS給藥 48h后，酪氨酸酶及其相關(guān)基因在蛋白水平上的表達(dá)明顯下調(diào)，且呈劑量依賴性，蛋白水平結(jié)果(圖4(b))與轉(zhuǎn)錄水平相符．這表明LAS給藥能夠抑制黑色素生成相關(guān)基因的表達(dá)．

圖4 LAS對酪氨酸酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of LAS on transcriptional expression of tyrosinase

2.5 LAS對MITF及TYR啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

為進(jìn)一步驗證 LAS對黑色素生成的抑制機(jī)理，對 TYR和 MITF的啟動子活性進(jìn)行了檢測，如圖 5所示．加入 LAS后能劑量依賴性的抑制 TYR 和MITF的啟動子活性，當(dāng)LAS的體積分?jǐn)?shù)為20%時，對 MITF的抑制率為 23.00%，對 TYR的抑制率為40.45%．結(jié)果可知，LAS能抑制 MITF和 TYR的啟動子轉(zhuǎn)錄活性．

圖5 熒光素酶活性分析LAS對TYR和MITF啟動子的影響Fig. 5 Effect of LAS on the promoter activity of TYR and MITF

3 討 論

由于黑色素在基底層的異常蓄積，導(dǎo)致人們遭受著黑斑病、雀斑等問題的困擾，影響人們的生活質(zhì)量．隨著對黑色素生物合成的不斷研究，研究者們發(fā)現(xiàn)了在黑色素合成過程中起關(guān)鍵作用的限速酶——酪氨酸酶，酪氨酸酶抑制劑成了解決黑色素合成的重要手段，一些美白產(chǎn)品也都加入了酪氨酸酶抑制劑．但是，大部分酪氨酸酶抑制劑的副作用也逐漸暴露出來，如熊果苷的光敏性、曲酸和維生素 C的低效能等情況．馮榮楷等[22]對 643個從文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫中取得的酪氨酸酶抑制劑進(jìn)行皮膚毒性研究，發(fā)現(xiàn)其中約一半帶有刺激性、腐蝕性或致癌性．因此，很有必要尋找更安全可用的酪氨酸酶抑制劑．已有研究[23]表明，從奶牛糞便中分離的乳酸菌菌株可用于開發(fā)酪氨酸酶抑制劑的潛在藥物．本研究中，LAS可以抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性，且對細(xì)胞的生長幾乎沒有影響，相比其他酪氨酸酶抑制劑來說使用更安全．并且發(fā)現(xiàn)，LAS對黑色素生成的抑制作用很可能是通過抑制 MITF和 TYR的啟動子轉(zhuǎn)錄活性，從而下調(diào)TYR、TRP-1、TRP-2及MITF的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而發(fā)揮的．

黑色素的生成還與氧自由基有關(guān)．研究[24]表明，氧自由基通過刺激黑色素激活因子如 PGE2和α-MSH的分泌來促進(jìn)黑色素的合成，導(dǎo)致色素沉著．因此，阻斷或清除自由基也可以抑制黑色素的形成．抗壞血酸、半胱氨酸等都是通過抗氧化性來抑制黑色素合成的．采用 ABTS和 DPPH自由基清除法對LAS的抗氧化活性進(jìn)行了分析，證明了LAS對自由基有一定的清除作用，尤其是對 ABTS的自由基清除活性很高．LAS中對黑色素生成有抑制作用的功能組分尚不明確，有研究[25]表明多糖類物質(zhì)可以抑制酪氨酸酶活性，且某些乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖可以降低 B16 細(xì)胞黑色素產(chǎn)量，LAS的主要功能組分可能是胞外多糖，但仍尚需進(jìn)一步研究．

4 結(jié) 語

本研究證明了植物乳桿菌 CGMCC8198的菌體破碎上清液具有很好的抗黑色素生成及抗氧化的功能，并揭示了益生菌抑制黑色素形成的部分作用機(jī)制，將為相關(guān)化妝品及功能產(chǎn)品的研發(fā)提供新思路．