肉葡萄球菌電轉化條件的優化

張變強，唐巧巧，柯靈超，張 健，王德培，朱 燕，高 強

(1. 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 天津科技大學后勤管理處，天津 300457)

肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)是目前葡萄球菌屬中被完全確認的一株食品級(generally recognized as safe，GRAS)菌株[1]．肉葡萄球菌作為肉制品發酵行業中形成肉制產品獨特風味的關鍵性菌種，很早就在歐洲尤其是德國，用于制造干火腿與干香腸的初始發酵劑[2]．此外，與其他革蘭氏陽性細菌如芽胞桿菌(Bacillus)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)等相比，肉葡萄球菌具有生長迅速、營養要求簡單、無外毒素、胞外蛋白酶水解活性低且能夠將蛋白質分泌至培養基中[2-3]的特點，使其不僅可以在代謝工程方面用來研究肉葡萄球菌及相關屬種的代謝途徑，而且還可以用于外源蛋白的表達和分泌研究．

然而，作為革蘭氏陽性細菌，肉葡萄球菌的細胞壁較厚且致密，感受態細胞接收外源載體困難，常規的熱激轉化法幾乎無法使外源 DNA進入宿主細胞．目前，肉葡萄球菌的外源 DNA轉化方法主要有原生質體轉化方法和電轉化方法．原生質體轉化方法操作復雜、花費時間較長且轉化效率較低，而電轉化法操作簡便、理論轉化效率高，因而得到廣泛的應用[4]．電轉化法的原理是使用瞬時電壓使得細胞膜被極化而產生瞬時孔洞，使 DNA等外源物質快速進入到細胞內[5]．電場強度和脈沖持續時間在一定范圍內時，細胞的瞬時通透性是可逆的．隨著電場強度的增加，細胞膜通透性越高，產生的疏水孔洞也越多，外源 DNA越容易進入到細胞，但隨著電場強度的不斷增加，細胞的死亡率也會急劇增加[6]．所以，在電轉化過程中需要平衡轉化效率和死亡率的關系，既要提高電場強度，提高轉化效率，又要盡可能降低細胞死亡率．如果在電轉化過程中添加合適的高滲溶液給予細胞一定的保護，可以提高細胞的存活率，進而提高細胞的電轉化效率．Loefblom 等[5]建立了S.carnosus TM300的電轉化方法，但是操作繁瑣，轉化不夠穩定，并且未做高滲溶液方面的研究．因此，亟待建立一個更為穩定高效的適合 S.carnosus的電轉化方法．

增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)是在野生型 GFP的基礎上，采用定點突變技術將Ser65和Phe64分別用Thr和Leu替代而成，通過改造大大增強了熒光亮度和穩定性，因此比GFP更適用于生命科學各個領域的研究[7]．

本研究在前期研究[8-9]的基礎上，首先優化細菌生長狀態、電壓、質粒質量濃度，初步確定較優條件，繼而對電擊緩沖液、復蘇培養基組分、復蘇培養時間進行優化，以期提高肉葡萄球菌的轉化效率，為后續的研究奠定電轉化方法學的基礎．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α 由本實驗室保存；肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)TM300、pBT2質粒(氯霉素抗性(Cmr)與氨芐青霉素抗性(Ampr))，由德國圖賓根大學微生物遺傳學研究所Friedrich Goetz教授饋贈；E.coli-Staphylococci穿梭質粒pBT2-ET-4C-5R-EGFP，由S.carnosus TM300雙精氨酸轉運(Twin arginine translocation，Tat)信號肽與EGFP組成的融合蛋白，本實驗室以pBT2質粒為骨架構建，具體的構建過程參考中國發明專利申請：一種肉葡萄球菌的電轉化方法及其應用(申請號：201710958394.5，中華人民共和國國家知識產權局)．

1.1.2 培養基和緩沖液

LB 培養基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌20min；固體培養基需添加瓊脂粉20．

B2培養基(g/L)：水解酪蛋白 10，酵母提取物25，葡萄糖 5，NaCl 25，K2HPO41，去離子水配制，pH 7.5，0.67×105Pa滅菌 15min．

LBC 復蘇培養基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，0.5mol/L 蔗糖，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌 20min．

LBS復蘇培養基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，0.5mol/L 山梨醇，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌 20min．

LBM 復蘇培養基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，0.3mol/L 甘露醇，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌 20min．

TSB 固體培養基(g/L)：酪蛋白 17，大豆蛋白胨3，葡萄糖 2.5，NaCl 5，K2HPO42.5，pH 7.5，瓊脂粉20，去離子水配制，0.67×105Pa滅菌15min．

Glc電擊緩沖液：10%甘油，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌 20min．

GM 電擊緩沖液：10%甘油，0.5mol/L甘露醇，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌20min．

GS電擊緩沖液：10%甘油，0.5mol/L山梨醇，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌20min．

GSM 電擊緩沖液：10%甘油，0.5mol/L甘露醇，0.5mol/L山梨醇，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌20min．

GC電擊緩沖液：10%甘油，0.5mol/L蔗糖，去離子水配制，pH 7.5，0.67×105Pa滅菌20min．

12%分離膠(15mL)：ddH2O 4.9mL，Tris-HCl(1.5mol/L，pH 8.8)3.8mL，30%丙烯酰胺6.0mL，10% SDS 0.15mL，10%過硫酸銨 0.15mL，TEMED 6μL．

5%濃縮膠緩沖液(5mL)：ddH2O 3.4mL，Tris-HCl(1.0mol/L，pH 6.8)0.63mL，30%丙烯酰胺0.83mL，10% SDS 0.05mL，10%過硫酸銨0.05mL，TEMED 5μL．

1.1.3 主要儀器設備

BTX ECM399型指數衰減波電穿孔系統電轉化儀、BTX 610型電轉杯(間距 2mm)，美國 BTX 公司；核酸定量儀，德國 IMPLEN公司；ZWYR-D2403型恒溫培養振蕩搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；DYY-4C型穩壓穩流電泳儀、DYCZ-40E型半干轉膜儀，北京六一儀器廠．

1.2 方法

1.2.1 質粒的提取與定量檢測

使用天根生化科技(北京)有限公司生產的DP103質粒小提試劑盒提取 E.coli DH5α/pBT2-ET-4C-5R-EGFP質粒，并在電轉化S.carnosus TM300之前使用核酸定量儀測定質粒濃度．

1.2.2 S.carnosus TM300感受態細胞的制備

挑取S.carnosus TM300單菌落接種到裝有5mL LB培養基的試管中，37℃、180r/min培養 12～16h．將過夜培養的S.carnosus TM300菌液按照1%的接種比例接種在裝有 50mL B2培養基的 250mL三角瓶中，37℃、180r/min培養至對數生長期(A578=0.6)時停止培養．將含有菌液的三角瓶冰浴 15min，分裝于 50mL預冷過的離心管中，4℃、5000r/min離心10min，棄去上清液．分別用40mL與20mL冰冷的 GS電擊緩沖液充分懸浮菌體，4℃、5000r/min離心 10min，棄去上清液，接著用 10mL冰冷的 GS電擊緩沖液洗滌菌體3次．最后用800μL冰冷的GS電擊緩沖液重懸，分裝于1.5mL滅菌離心管中，每管100μL，-80℃保存．

1.2.3 電轉化

將 S.carnosus TM300感受態細胞從-80℃取出，冰上解凍 5min．在解凍后的感受態細胞中加入500ng質粒充分混勻，將全部液體轉移到2mm電極間距的電轉杯中，置于冰上作用30min后，使用電轉儀進行電轉化，電擊電壓為2450V，電擊后顯示的脈沖時間為 6ms．電擊后迅速將 1mL LBM 復蘇培養基加到電轉杯中，將全部液體轉到1.5mL離心管中，37℃、180r/min搖床復蘇培養4h．吸取100μL培養液涂布于含終質量濃度為10μg/mL Cmr的TSB培養基平板，37℃過夜培養，直至出現轉化子，計數轉化子并按照式(1)計算轉化效率．

1.2.4 引物合成

為了驗證轉化子，設計引物 egfp-F/egfp-R擴增目的基因 egfp．引物序列為 egfp-F：5'-ATTTGTCCT ACTCAGGAGAGCGTTC-3'，egfp-R：5'-GAGTTGCT AGTAACATCTGACCGA-3'．

1.2.5 轉化子驗證

為了驗證電轉化得到的轉化子，隨機選擇5個轉化子，用含有10μg/mL Cmr的液體LB培養基過夜培養．收集菌體細胞，提取質粒，以轉化子質粒為模板，egfp-F/egfp-R為上、下游引物通過 PCR反應擴增目的基因egfp，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測[9]．

1.2.6 EGFP的表達

分別接種陽性轉化菌株 S.carnosus TM300/pBT2-ET-4C-5R-EGFP和陰性對照菌株 S.carnosus TM300于 5mL LB培養液中，37℃、180r/min過夜培養，然后按 1%的接種量將過夜培養物轉接至50mL LB培養液中，37℃、180r/min繼續培養16h，以表達EGFP．

1.2.7 目的蛋白EGFP的檢測

熒光顯微鏡觀察：取5μL按1.2.6節方法培養的菌液，滴在載玻片表面并蓋好蓋玻片，置于熒光顯微鏡下觀察菌液的熒光產生情況．

分別提取陽性轉化菌株與陰性對照菌株發酵液中的蛋白質，使用5%的濃縮膠和12%的分離膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測及免疫印跡(Western blot)測定．

2 結果與分析

2.1 細胞生長時期對轉化效率的影響

為了研究S.carnosus TM300的不同生長時期對感受態細胞的制備和后續電轉化的影響，在培養細胞的 A578值分別為 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 時停止培養并收集菌體，按照1.2.2節中的S.carnosus TM300感受態制備方法，獲得不同生長時期的感受態細胞(圖 1)．

圖1 S. carnosus TM300的生長曲線Fig. 1 Growth curve of S. carnosus TM300

將穿梭載體 pBT2-ET-4C-5R-EGFP用電轉化方法轉化至感受態細胞中，復蘇培養后涂布于含有10μg/mL氯霉素的 TSB固體培養基平板，計數轉化子菌落并計算轉化效率(圖 2)，其中電擊緩沖液為GSM，復蘇培養基為 LB液體培養基．當 A578=0.6時，轉化效率達到最高，為 0.53×103μg-1．結合圖 1可知，此時菌體處于指數生長的中前期階段，細胞生長比較旺盛，電轉化效率最佳．

圖2 菌體生長A578值對電轉化效率的影響Fig. 2 Effect of A578 density on the electroporation efficiency

2.2 不同電擊電壓對轉化效率的影響

在 A578=0.6時收集 S.carnosus TM300菌體用于制備感受態細胞．在電轉化步驟中，先將300ng穿梭載體加入感受態細胞，充分混勻后，分別在 1500、1750、2000、2250、2300、2400、2450、2500V 的電壓條件下進行電轉化．電擊完成后向電轉杯中加入1mL LB復蘇培養基，37℃、180r/min復蘇培養3～4h后涂布于含有10μg/mL氯霉素的TSB固體培養基平板，計數轉化子菌落，并計算不同電壓對應的轉化效率，結果如圖3所示．

圖3 電壓對電轉化效率的影響Fig. 3 Effect of voltage on the electroporation efficiency

由圖3可知：電壓在2450V時轉化效率達到最高，為 0.67×103μg-1；2500V 時的轉化效率略低于2450V時的轉化效率；而電壓為 1500V與 1750V時，轉化效率偏低．因此，S.carnosus TM300最適電轉化電壓為2450V左右，且電壓宜高不宜低．

2.3 質粒質量濃度對轉化效率的影響

為了研究質粒質量濃度對S.carnosus TM300電轉化效率的影響，本研究選用經過上述優化的感受態細胞，分別取 10、50、100、500、1000、2000ng 穿梭質粒加入到100μL感受態細胞中，在2450V電壓下進行電轉化．由圖4可知：在10～100ng/100μL的質粒質量濃度范圍內，轉化效率較低；在 500ng/100μL時達到最高，為1.01×103μg-1；但是在質粒質量濃度不斷升高時，轉化效率反而呈下降趨勢；當加入2000ng/100μL質粒時，轉化效率下降至 0.046×103μg-1．

圖4 質粒質量濃度對電轉化效率的影響Fig. 4 Effect of plasmid DNA concentration on the electroporation efficiency

2.4 電擊緩沖液對轉化效率的影響

在 A578=0.6時收集 S.carnosus TM300菌體制備感受態細胞．制備感受態時用不同的電擊緩沖液(Glc電擊緩沖液、GM電擊緩沖液、GS電擊緩沖液、GSM 電擊緩沖液、GC電擊緩沖液)洗滌細胞，其余實驗條件與優化前相同．由圖 5可知，用 GS電擊緩沖液制備的感受態細胞進行電轉化，轉化效率最高，轉化效率可達 3.89×103μg-1．

圖5 電擊緩沖液對電轉化效率的影響Fig. 5 Effect of electroporation medium on the electroporation efficiency

由圖 5結果分析：將甘油作為電擊緩沖液使用時，轉化效率較低，當在電擊緩沖液中加入 0.5mol/L的甘露醇或者山梨醇時，轉化效率大幅度提高；當山梨醇、甘露醇以等物質的量加入時，轉化效率反而下降，因此，確定電擊緩沖液的最佳組成成分為 10%甘油與0.5mol/L山梨醇．

2.5 復蘇培養基對轉化效率的影響

夏子芳等[11]對乳桿菌的電轉化條件進行了優化，發現細胞在電擊以后由于受到電壓的創傷很容易死亡，如果此時在復蘇培養基中加入合適的高滲溶液，可以有效保護細胞，從而提高細胞的存活率，最終提高電轉化效率．在 S.carnosus TM300菌體生長到A578=0.6時，收集菌體制備感受態，在電轉化步驟加入 500ng穿梭載體進行電轉化．電擊后立即加入1mL含0.5mol/L不同高滲溶液(蔗糖、甘露醇、山梨醇)的復蘇培養基，復蘇培養后涂布于含有 10μg/mL氯霉素的 TSB固體培養基平板，37℃過夜培養后計數轉化子菌落，計算轉化效率．由圖 6可知，電擊后加入含 0.5mol/L甘露醇的復蘇培養基，轉化效率最高，達到 4.84×103μg-1．

圖6 復蘇培養基對電轉化效率的影響Fig. 6 Effect of different osmotic stabilizers in recovery media on the electroporation efficiency

隨后為了研究不同濃度的甘露醇對轉化效率的影響，在 LB復蘇培養基中分別加入 0.1、0.3、0.5mol/L甘露醇，涂板后觀察結果(圖7)．

圖7 復蘇培養基中甘露醇濃度對電轉化效率的影響Fig. 7 Effect of mannitol concentrations in recovery media on the electroporation efficiency

由圖 7可知，當復蘇培養基中含有 0.3mol/L甘露醇時，轉化效率最高，達到 5.70×103μg-1．由此得出，在復蘇培養基中加入0.3mol/L甘露醇時，轉化效率最高；甘露醇的濃度過高時，轉化效率呈下降趨勢.

2.6 復蘇時間對轉化效率的影響

本研究選用經過上述優化的感受態細胞，加入500ng/100μL 質粒電擊后，分別孵育 1、2、3、4、5、6h，然后涂布于含有10μg/mL Cmr的TSB固體培養基平板，轉化效率結果如圖8所示．

圖8 復蘇時間對電轉化效率的影響Fig. 8 Effect of incubation time on the electroporation efficiency

由圖 8可知：細胞復蘇時間達到 4h時，轉化效率較好，達到 5.95×103μg-1；4h以后轉化效率增加不明顯，所以綜合考慮選擇4h為細胞復蘇時間．

2.7 肉葡萄球菌轉化子的驗證

為了驗證電轉化后得到的轉化子是否為陽性轉化子，本研究隨機挑取 5個轉化子，提取轉化子質粒，以該質粒為模板，egfp-F/egfp-R為上、下游引物，進行 PCR驗證．PCR產物用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，結果如圖9所示．

pBT2-ET-4C-5R-EGFP作為陽性對照，對各轉化子質粒的 PCR驗證均在 1440bp左右出現目的條帶，且與陽性對照結果一致，證明質粒 pBT2-ET-4C-5R-EGFP成功地轉化到S.carnosus TM300宿主中．

2.8 熒光顯微鏡觀察

使用NIKON ECLIPSE TE2000-U型熒光顯微鏡觀察轉化子菌液，結果如圖 10所示．與圖 10(a)的S. carnosus TM300陰性對照對比觀察可知，圖10(b)中構建成功的S. carnosus TM300轉化株發出綠色熒光，說明載體pBT2-ET-4C-5R-EGFP編碼的EGFP蛋白能夠以活性形式得到表達．

圖10 EGFP熒光顯微鏡觀察Fig. 10 Fluorescence observation of EGFP expression

2.9 SDS-PAGE與Western blot分析

分別提取S.carnosus TM300及轉化菌株發酵液中的蛋白，進行SDS-PAGE蛋白電泳及Western blot蛋白免疫印跡．如圖 11和圖 12所示，野生型菌株S. carnosus TM300作為陰性對照，其發酵液中沒有出現目的條帶，而轉化菌株均在 5.4×104左右處有目的條帶．表明肉葡萄球菌轉化株成功地將表達的EGFP以二聚體形式分泌至細胞外的發酵液環境中．

3 討 論

電轉化法作為一種高效的轉化方法，目前廣泛應用于外源基因轉染等多個領域[10]．但在實際操作過程中，電轉化的轉化效率受到諸多因素的影響，包括細菌生長狀態、生長培養基組分、電擊緩沖液組分、電擊電壓、脈沖時間、電場強度、電阻、質粒 DNA 濃度、復蘇培養基組分[11]、復蘇時間[12]等多個方面．為了提高電轉化效率，不同菌株和質粒的電轉化都需要對電轉化條件作出調整和優化．

本研究對影響S.carnosus TM300電轉化效率的有關參數進行了優化，研究發現，S.carnosus TM300在 A578=0.6時有最高的轉化效率，達到 0.53×103μg-1．另外，對影響電轉化的電壓和質粒質量濃度因素進行了優化，研究發現，在電壓為2450V時，電轉化效率最高，達到0.67×103μg-1．電壓過低或過高都會對電轉化效率產生顯著的影響，其原因可能是電壓過低時細胞表面的動作電位處于不應期的時間較長[13]，細胞無法產生孔隙，外源 DNA 從而無法進入細胞；電壓過高時，細胞在瞬時高壓下產生不可逆損傷，導致細胞大量死亡．同時，質粒質量濃度對電轉化效率的影響也較大．在本研究中，質粒質量濃度為500 ng/100μL時，電轉化效率最高，達到 1.01×103μg-1．質粒質量濃度過高或過低都會導致電轉化效率降低，出現這種情況的原因可能是質粒 DNA濃度過低時，DNA分子數量太少，細胞未得到充分利用，轉化效率偏低；而當質粒質量濃度過高時，細胞所能夠吸收的 DNA分子達到過飽和的狀態，反而不利于轉化，肖沖等[14]在乳酸菌電轉化條件的優化研究中也證實了這一點．研究還發現，洗滌緩沖液對感受態細胞的制備影響較大，用山梨醇、甘露醇、蔗糖等高滲劑配成高滲溶液洗滌菌體細胞，電轉化效率有顯著提高．其原因可能是一方面高滲溶液能夠降低細胞表面的離子強度，另一方面能夠給細胞提供一個高于細胞質滲透壓的環境而促進細胞收縮，進而增強細胞膜的再密封能力，降低胞內物質的流出速度，最終提高細胞的存活率[15]．實驗結果表明，使用 10%甘油與0.3mol/L甘露醇配成的高滲溶液洗滌菌體細胞的轉化效果最好，轉化效率提高至 3.89×103μg-1．此外，電擊后在復蘇培養基中加入山梨醇、甘露醇等滲透壓保護劑時，對 S.carnosus TM300的轉化效率也有顯著的提高，當加入的甘露醇為0.3mol/L時，轉化效率可達 5.70×103μg-1，這與 Xue等[16]對枯草芽胞桿菌電轉化的研究結果相類似．另外，電擊后的復蘇時間對轉化效率也具有顯著的影響，當復蘇時間為 4h時，電轉化效率較好，達到 5.95×103μg-1．復蘇時間之所以對轉化效率有影響，原因可能是電擊后細胞表面會產生孔隙，而要閉合孔隙，需要將細胞置于含有特定高滲溶液的復蘇培養基中培養一段時間，使細胞孔隙閉合復原，從而有助于提高細胞的存活率，進而提高轉化效率[17]．對經過上述優化得到的轉化株檢測發現，EGFP蛋白在 S.carnosus TM300中成功表達，并能夠以二聚體形式轉運至發酵液中．這可能是聚合界面的疏水性氨基酸殘基較多[18]，導致 EGFP蛋白聚合所致．

綜上所述，通過優化以上電轉化參數，S.carnosus TM300的電轉化效率達到 5.95×103μg-1，比高強等[7]以前報道的轉化效率提高了 5倍，且目的蛋白EGFP成功分泌至發酵液中．優化后的電轉化方法可以用于肉葡萄球菌的基因高效轉化，為今后肉葡萄球菌的基因工程改造以及合成生物學等研究奠定了有力的電轉化方法學基礎．