基于人皮瓣核酸內(nèi)切酶抗癌策略的研究進(jìn)展

馬 龍，王海月，周 津，曹秀琪

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

惡性腫瘤已成為威脅人類健康的頭號(hào)殺手．研究[1]估計(jì)，2018年全球范圍內(nèi)將會(huì)有1810萬癌癥新增病例和960萬癌癥死亡病例，并且預(yù)計(jì)癌癥將成為21世紀(jì)世界上每個(gè)國家人民的主要死亡原因和提高壽命最重要的障礙．因此，研究癌癥成因和發(fā)展機(jī)制，找到高效合理的預(yù)防和治療手段，是醫(yī)藥工作者的重大命題．雖然人類已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，有不少有效的藥物被應(yīng)用于臨床，但是找到新的藥物靶點(diǎn)，使藥物能夠選擇性的殺滅癌細(xì)胞，降低藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用和防止癌癥復(fù)發(fā)，仍是抗癌藥物研發(fā)所面臨的巨大挑戰(zhàn)．

不少的抗癌藥物都是通過引起過度的 DNA損傷來抑制癌癥[2]，因此癌細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出高效、保守的 DNA修復(fù)系統(tǒng)，以防止內(nèi)源和外源 DNA損傷．然而當(dāng)特異性 DNA修復(fù)酶含量增加時(shí)，可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的抗性[3]，因此人皮瓣內(nèi)切酶1(human flap endonuclease 1，F(xiàn)EN1)作為一種結(jié)構(gòu)特異型的5′-核酸酶，因其在DNA復(fù)制和修復(fù)中的重要作用引起了研究者的注意．研究[4]顯示，使用 FEN1抑制劑可以直接殺死癌細(xì)胞或者增敏某些 DNA損傷劑(DNA damaging agent)．FEN1還可以通過涉及“合成致死性”的機(jī)制選擇性殺死癌細(xì)胞．因此，在基于遺傳和組合抗癌治療模式中，開發(fā)功能有效的小分子FEN1抑制劑以降低FEN1的活性，在開發(fā)靶向抗腫瘤藥物中具有重要意義．

1 FEN1的生物學(xué)功能和作用機(jī)制

FEN1能夠特異性地切除在DNA聚合酶催化的DNA鏈置換合成過程中產(chǎn)生的 5′端單鏈 DNA或者RNA[5]．FEN1是一種結(jié)構(gòu)特異型核酸酶，需要二價(jià)金屬離子才能發(fā)揮催化作用[6]．FEN1是真核生物后隨鏈復(fù)制(lagging-strand DNA replication)、長補(bǔ)丁堿基切除修復(fù)(long-patch base excision repair，LP-BER)以及核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair，NER)中不可或缺的重要酶[7]．另外，F(xiàn)EN1還在維持端粒穩(wěn)定性、重啟停滯的復(fù)制叉、DNA碎片化和處理三核苷酸串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)(trinucleotide repeat expansion，TRN)上起重要作用[8]．研究[9]表明，F(xiàn)EN1主要有維持端粒穩(wěn)定、進(jìn)行堿基和核苷酸切除修復(fù)以及促進(jìn)岡崎片段成熟的功能．在DNA復(fù)制和修復(fù)中，F(xiàn)EN1和PCNA(proliferating cell nuclear antigen)相互作用形成“滑行夾”，然后去完成核酸切割任務(wù)[10]. 在DNA堿基切除修復(fù)中，一分子的 FEN1和一分子的APE1(human AP endonuclease)相結(jié)合，APE1協(xié)同F(xiàn)EN1作用并增強(qiáng)其活性[11]．在維持端粒穩(wěn)定性方面，F(xiàn)EN1和端粒酶形成復(fù)合物，并在端粒酶介導(dǎo)的端粒穩(wěn)定性上發(fā)揮作用[12]．在酶學(xué)機(jī)制上，F(xiàn)EN1的底物DNA中未能配對(duì)的5′-單鏈部分，通過一種“雜亂-穿孔-有序”(disorder-thread-order)的機(jī)制穿過FEN1的螺旋狀門道結(jié)構(gòu)(helical arch)．并且 FEN1通過一種“去堿基配對(duì)化(unparing)”的機(jī)制去定位切割位點(diǎn)，以便進(jìn)行正確的切割[13-15]．底物 DNA 的5′末端的單鏈部分穿過僅能夠容納單鏈 DNA的螺旋狀門道結(jié)構(gòu)，而其雙鏈部分不能穿過，所以不能接觸到酶的活性口袋(圖 1[6])．在 5′端的單鏈區(qū)穿過螺旋狀門道結(jié)構(gòu)后，F(xiàn)EN1將+1和-1堿基(+1和-1代表 FEN1切割的磷酸二酯鍵所連接的兩個(gè)堿基，+1在 5′端，-1在 3′端)和原來互補(bǔ)鏈的配對(duì)堿基分離，伸向酶的活性中心，這樣就只有應(yīng)該被剪切的磷酸二酯鍵才能夠和活性中心的氨基酸殘基接觸，接近兩個(gè)二價(jià)金屬陽離子，以完成DNA切割(圖2[6])．這兩種機(jī)制使得FEN1擁有結(jié)構(gòu)特異性的DNA切割能力，并且發(fā)現(xiàn)了活性中心的Y40、R93、R100對(duì)FEN1的活性和作用有巨大影響，在底物切割特異性上發(fā)揮重要作用．單分子熒光能量共振轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)(Singlemolecule fluorescence resonance energy transfer)以及生物物理學(xué)研究顯示，F(xiàn)EN1應(yīng)用誘導(dǎo)契合模型(induced-fit)來完成底物的特異性選擇[16]．正是FEN1的這種精準(zhǔn)、特異的 DNA底物切割機(jī)制保證了基因組的穩(wěn)定性[17]．

圖1FEN1和底物 DNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)功能單元Fig. 1 Crystal structure and functional components of FEN1 and substrate DNA complexes

圖2 FEN1與底物切割模式Fig. 2 Cleavage pattern of FEN1

2 FEN1在癌癥中的作用

鑒于 FEN1在維持基因組完整性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，并且其在多種癌癥類型中過度表達(dá)，因此它可能作為一種腫瘤治療靶點(diǎn)[18-19]．在 FEN1與腫瘤相關(guān)性的方面有不少的報(bào)道：(1)其在前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[20-23]；(2)可作為乳腺癌、卵巢癌、胃癌等腫瘤的生物標(biāo)志物，而且可以增加肺癌、胃腸癌的易感性[24-28]；(3)FEN1的高表達(dá)與腫瘤病人的低生存率密切相關(guān)，同時(shí)還與進(jìn)行前列腺切除術(shù)的前列腺癌病人的不良預(yù)后正相關(guān)[22,25,29-30]；(4)敲低 FEN1有抑制 RAD54B突變的人結(jié)直腸癌細(xì)胞、抑制人前列腺癌細(xì)胞的生長以及增敏曲妥珠單抗的作用，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺和順鉑的敏感度；(5)紫杉醇聯(lián)合FEN1抑制劑對(duì)宮頸癌細(xì)胞具有協(xié)同抗腫瘤作用[31]. 因此，抑制FEN1可起到抑制腫瘤細(xì)胞的作用[22,32-37].

3 從合成致死角度探索 FEN1抑制劑抗腫瘤的思路

新的抗腫瘤藥物開發(fā)原理被不斷提出，美國科學(xué)家Lee Hartwell和Stephen Friend最早提出了將合成致死性概念用于癌癥的治療[38]．所謂合成致死，簡單地說就是指在兩個(gè)非致死基因中，若僅其中的一個(gè)基因發(fā)生了變異，細(xì)胞仍會(huì)存活，若兩個(gè)基因同時(shí)發(fā)生變異，則將引起細(xì)胞死亡，這兩個(gè)基因則構(gòu)成合成致死搭檔(partner)．合成致死策略為尋找抗癌的新靶點(diǎn)提供了全新的思路．癌細(xì)胞由于其基因缺陷使它們?cè)诤铣芍滤佬悦媲白兊酶嗳酰@種腫瘤特異性缺陷正好可以被用來研發(fā)靶向藥物[39-40]．比如，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中某個(gè)基因失活或者用藥物抑制某個(gè)基因，與之構(gòu)成合成致死搭檔的另外的一個(gè)基因就有可能成為潛在的“靶基因”，那么針對(duì)這個(gè)“靶基因”的抑制劑就能夠特異性的殺死癌細(xì)胞，并且不會(huì)影響正常細(xì)胞的存活(圖 3和圖 4)．總之，合成性致死方法是利用腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞間的基因差異來最大化地發(fā)揮對(duì)癌細(xì)胞的殺滅作用，同時(shí)將對(duì)正常細(xì)胞的副作用最小化．因此，合成致死方法針對(duì)了不同的基因型，從而可以為病人提供更具個(gè)性化的治療[41]，達(dá)到“精準(zhǔn)”治療腫瘤的目的[42]．

圖3 合成致死性原理Fig. 3 Principle of synthetic lethality

圖4 合成致死性方法在抗腫瘤藥物研究中可能的應(yīng)用Fig. 4 Possible applications of synthetic lethality in anticancer drug development

基因組的不穩(wěn)定性和基因突變被公認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的一大特征[43]．DNA損傷及由腫瘤細(xì)胞活躍的生長因子和原癌基因誘導(dǎo)的 DNA復(fù)制壓力造成了基因組的不穩(wěn)定．DNA損傷修復(fù)基因(DNA damage response，DDR)的突變或沉默在腫瘤細(xì)胞中很常見，所以 DDR基因也被認(rèn)為是一類抑癌基因．在腫瘤中，一些 DDR基因的缺失導(dǎo)致其他 DNA修復(fù)元素代償性地上調(diào)，這樣就會(huì)對(duì)基于破壞 DNA的放化療(如 DNA烷化劑等)產(chǎn)生抵抗性，造成治療效果不佳或耐藥性[44-45]．因此，癌細(xì)胞為了生存而過度依賴的被上調(diào)的 DDR通路就可以被作為靶點(diǎn)進(jìn)行抑制，以引發(fā)不可修復(fù)的 DNA損傷，達(dá)到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的．簡單地說就是 DDR修復(fù)的多重機(jī)制中潛在地存有多對(duì)合成致死搭檔[46-47]．一個(gè)最明顯應(yīng)用合成致死的例子就是在癌細(xì)胞中的 BRCA1/2(breast cancer susceptibility gene，BRCA)參與DNA修復(fù)，其突變?cè)斐?DNA修復(fù)障礙，與其協(xié)同修復(fù) DNA的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP)ribose polymerase，PARP)旁路則成為癌細(xì)胞更為倚重的修復(fù)途徑．在BRCA1/2突變的癌細(xì)胞對(duì) PARP抑制劑的敏感度比非突變細(xì)胞大兩個(gè)數(shù)量級(jí)[48]．在 2016年被 FDA獲批上市的 PARP抑制劑 Rucaparib(AG 014699)正是利用了這一原理設(shè)計(jì)產(chǎn)生的，并且臨床試驗(yàn)證實(shí)其對(duì)鉑類藥物敏感的高度惡化的漿液性卵巢癌、子宮內(nèi)膜上皮癌、原發(fā)性腹膜癌、輸卵管癌和有害生殖系統(tǒng)或體細(xì)胞BRCA1/2突變的三陰性乳腺癌等有明顯的活性[49-52]．有意思的是，盡管 PARP抑制劑最初被設(shè)計(jì)用來作為抗腫瘤藥物的增敏劑，但是有研究顯示某些PARP抑制劑(如Olaparib，已由FDA批準(zhǔn))作為單獨(dú)用藥在對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用也非常突出[53]．研究發(fā)現(xiàn) FEN1和人體中諸多癌癥相關(guān)基因如 RAD54B、CDC4、MRE11A、RNF20和 SMC3構(gòu)成合成致死搭檔．其中 RAD54B是一種在體細(xì)胞突變成癌細(xì)胞的過程中發(fā)生變異的基因，具有影響染色體穩(wěn)定性的作用[32]；CDC4是一種在多種腫瘤中突變的基因(如前列腺癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌)；RNF20、SMC3和MRE11A 是在結(jié)腸直腸癌中高突變的基因[33]．研究表明，F(xiàn)EN1在細(xì)胞中可以與多種蛋白交互作用以控制形成信號(hào)網(wǎng)絡(luò)[54]，這就為合成致死策略提供了可能．事實(shí)上，F(xiàn)EN1被認(rèn)為可能與DDR通路中的多個(gè)重要基因構(gòu)成合成致死搭檔，這些基因的突變可在多種不同腫瘤中出現(xiàn)[55]．DNA修復(fù)機(jī)制與 FEN1抑制劑的作用如圖 5所示，其中：BRCA表示乳腺癌易感基因，F(xiàn)ANC表示范科尼貧血互補(bǔ)基因，ATM表示毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變基因，DNA-PK表示DNA依賴性蛋白激酶，XRCC表示X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白．

圖5 DNA修復(fù)機(jī)制與FEN1抑制劑的作用Fig. 5 DNA repair mechanism and the roles of FEN1 inhibitors

為了修復(fù)內(nèi)源和外源 DNA損傷，細(xì)胞應(yīng)用一系列DNA修復(fù)機(jī)制．總體上可以分為DNA單鏈(DNA single-strand break)和 DNA雙鏈斷裂(DNA doublestrand break)修復(fù)機(jī)制．其中 DNA 單鏈斷裂修復(fù)又包括堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)；DNA雙鏈斷裂修復(fù)包括同源重組和非同源末端連接．而能夠與FEN1抑制劑(藍(lán)色實(shí)線橢圓)構(gòu)成潛在合成致死性搭配的其他 DNA修復(fù)系統(tǒng)(紅色點(diǎn)線橢圓)的缺失，經(jīng)常在癌細(xì)胞中出現(xiàn)．因此，F(xiàn)EN1的小分子抑制劑是潛在的新型抗癌藥物．

4 FEN1抑制劑的研究進(jìn)展

近年來關(guān)于FEN1抑制劑的報(bào)道逐漸增多，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠在蛋白表達(dá)水平上下調(diào)FEN1的表達(dá)，這可能是姜黃素抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制之一[56]；還發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠通過對(duì) FEN1的下調(diào)增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[57]．中藥鐵筷子中分離的一種強(qiáng)心苷類成分HTF-1能劑量依賴性地下調(diào)FEN1的表達(dá)，這也是此化合物能夠抑制癌細(xì)胞的原因之一[58]. FEN1酶活性抑制劑包括 NSC-281680[34]和NSC-13755[59]．NSC-281680能夠抑制 FEN1的核酸內(nèi)切酶活性，進(jìn)而影響長補(bǔ)丁堿基切除修復(fù)．此化合物能夠增敏 DNA烷基化抗腫瘤藥物替莫唑胺對(duì)HCT-116人結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性，為聯(lián)合用藥提供了一種可能[34]．通過基于機(jī)器學(xué)習(xí)的虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)一種名為JFD00950萘醌類化合物具有FEN1催化抑制活性[60]．事實(shí)上，研究最充分的是基于 N-羥基脲類化合物的抑制劑．這種抑制劑在 2005年被首次報(bào)道，在酶水平上其具有納摩爾級(jí)別的 IC50值，其可能的抑制 FEN1酶活的抑制機(jī)制為其能夠配位結(jié)合(coordination)FEN1發(fā)揮活性所必需的二價(jià)金屬鎂金屬離子，其可能的兩種模式如圖 6所示[35]．在2016年英國謝菲爾德大學(xué)的 Jane Grasby教授對(duì)這類抑制劑進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，得到了FEN1與化合物1的共結(jié)晶，這為研究 N-羥基脲類化合物的 FEN1抑制活性提供了非常重要的依據(jù)[61]．化合物 1(圖 7)能夠通過抑制 DNA底物的“去堿基配對(duì)化”抑制FEN1的活性，并且化合物 1能夠明顯增敏 SW620人結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)甲基磺酸甲酯(MMS)的敏感型．此后其他研究組也陸續(xù)報(bào)道N-羥基脲類化合物能抑制細(xì)胞增殖，激發(fā)染色體不穩(wěn)定性，并且能夠增敏某些DNA損傷型抗腫瘤藥物，這一結(jié)論在細(xì)胞和動(dòng)物模型中得到證實(shí)[62]．

圖6 N-羥基脲類化合物的可能作用機(jī)制Fig. 6 Possible mechanism of N-hydroxyurea compounds

圖7 N-羥基脲類化合物中一種典型代表Fig. 7 A typical representative of N-hydroxyurea compounds

此外，近期報(bào)道[23,31,63]還顯示，N-羥基脲類化合物還能增敏化療藥物紫杉醇、逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性以及對(duì) PARP1和 PARP2缺失的細(xì)胞表現(xiàn)出高度藥物敏感性．

5 結(jié) 語

(1) FEN1是一個(gè)腫瘤抑制酶，其在維持基因組穩(wěn)定性方面具有重要作用，但是FEN1的過表達(dá)在多種腫瘤中出現(xiàn)，意味著其在腫瘤的快速增殖中扮演重要角色，可以潛在地作為多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的生物標(biāo)志物．

(2) FEN1在細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平或催化活性的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)過程值得關(guān)注．雖然已有一些FEN1抑制劑被發(fā)現(xiàn)，但是近年來關(guān)于新型的抑制劑報(bào)道很少，隨著FEN1晶體結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的逐步揭示，關(guān)于其抑制劑的研究也是今后的一個(gè)研究方向．

(3) 隨著FEN1和其合成致死搭檔的逐步揭示，F(xiàn)EN1抑制劑有可能在治療基因特異型腫瘤中發(fā)揮作用．