高靈敏共振光散射技術測定藥物及尿樣中氨曲南

何樹華, 曾慶瑞, 程乙真, 吳文婕, 江 虹

(長江師范學院化學化工學院，長江師范學院武陵山片區綠色發展協同創新中心，重慶 408100)

氨曲南(Aztreonam,ATN)是目前投入市場的第一個應用于臨床的新型單環β-內酰胺類抗生素，該藥對革蘭陰性菌具有很強的抗菌活性，臨床上主要用于治療革蘭陰性菌引起的各種感染，如由敏感菌所引起的呼吸系統感染、泌尿系統感染、生殖系統感染、皮膚感染及其它嚴重感染等。氨曲南的不良反應，如腹瀉、惡心、嘔吐、黃疸、藥物性肝炎、紫癜、皮疹等均較少見，但用藥過量或長期使用該藥時，會對肝、腎功能及造血系統造成較嚴重的影響。因此，研究測定ATN含量的方法，對于保障用藥安全具有重要意義。

目前，國內外對ATN含量的檢測方法研究較少，已報道的主要是高效液相色譜法[1 - 6]，也偶有原子吸收法[7]、熒光法[8 - 9]、電化學法[10]及液-質聯用法[11]等的報道。本工作以常見的堿性染料維多利亞藍B(VIB)為探針，用高靈敏共振光散射(RLS)技術測定ATN的含量，尚未見文獻報道。實驗發現，在堿性條件下，ATN與VIB締合物的RLS強度與ATN的濃度間有一定的線性關系。方法用于檢測藥物及人體尿液中ATN的含量，獲得較好結果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-2500型熒光分光光度計，日本日立公司；pHS-3C型酸度計，上海虹益儀器儀表有限公司。

氨曲南對照品(ATN)(96.9%，批號：130507-201303，中國食品藥品檢定研究院)溶液：準確稱取適量的ATN對照品于小燒杯中，加少許甲醇使其溶解，再轉入100 mL容量瓶中，用水定容，配成43.54 mg/L的貯備溶液，于冰箱4 ℃保存，臨用時稀釋成4.354 mg/L操作液。維多利亞藍B(VIB)(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)溶液：1.0×10-4mol/L。Tris-HCl緩沖溶液：分別取0.10 mol/L HCl和0.20 mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液適量，混合后，用酸度計測定其pH值，配成pH=3.0～9.8的系列溶液。實驗用水是二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

依序準確移取pH=9.34 Tris-HCl溶液3.00 mL，4.354 mg/L ATN標準溶液(或樣液)適量，1.00×10-4mol/L VIB溶液3.00 mL于10 mL具塞比色管中，加水定容，5 min后，在熒光光度計上，于λex=λem=220 nm處(測定狹縫5.0 nm)，同步掃描體系的共振光散射(RLS)光譜，測定最大散射波長處，體系溶液及試劑空白溶液的RLS強度IRLS及I0，并計算ΔIRLS(ΔIRLS=IRLS-I0)。

2 結果與討論

2.1 ATN-VIB的RLS光譜特征

圖1 氨曲南與維多利亞藍B的RLS光譜Fig.1 RLS spectra of aztreonam and victoria blue B1.0.435 mg/L ATN;2.3.00×10-5 mol/L VIB;3 - 9:0.0,0.0871,0.174,0.261,0.348,0.435,0.523 mg/L ATN-3.00×10-5 mol/L VIB, pH=9.34.

ATN與VIB反應體系的RLS光譜見圖1。從圖可知，ATN和VIB本身的RLS光譜均很微弱(曲線1和2)，當它們在pH=9.34的堿性條件下反應生成締合物后，共振光散射強度明顯增強，最大共振散射峰位于370 nm，在此波長下，共振光散射強度IRLS隨著ATN濃度的增大而增強(曲線3～9)，并且ATN在一定濃度范圍內與IRLS的增強強度呈線性關系，故該方法可用于ATN的定量分析。

反應機理：VIB在溶液中以陽離子形式存在，而ATN分子結構中有一個磺酸根離子和一個羧酸根離子，在溶液中VIB與ATN可以靜電引力結合生成二元離子締合物，使體系摩爾質量增大(由原來ATN的摩爾質量增大到ATN與VIB結合生成的締合物的摩爾質量)，故體系的RLS明顯增強。

2.2 反應條件

2.2.1 溶液pH的影響室溫下，試驗了甲基紫-ATN、堿性品紅-ATN及VIB-ATN體系在同一酸性或同一堿性條件下對RLS的影響。結果表明，在堿性Tris-HCl介質中，VIB-ATN體系有較強的RLS信號，故選用VIB作探針測定ATN。繼而改變反應體系中Tris-HCl溶液的pH值，考察其對ΔIRLS的影響，結果見圖2。反應在pH=8.5～9.8范圍內，體系有較大且較穩定的ΔIRLS，即有較高的靈敏度。實驗選用pH=9.34，當緩沖溶液用量為3.00 mL時，體系ΔIRLS相對最大且穩定。故實驗用pH=9.34的Tris-HCl溶液3.00 mL來控制反應的酸度。

2.2.2 VIB溶液濃度的影響室溫下，改變反應體系中VIB溶液的濃度，考察其對ΔIRLS的影響，結果見圖3。VIB溶液濃度在2.70×10-5～3.30×10-5mol/L范圍內，體系有較大且穩定的ΔIRLS，濃度為3.00×10-5mol/L時ΔIRLS達最大，靈敏度最高。VIB溶液的濃度大于或小于3.00×10-5mol/L，反應體系的ΔIRLS均有不同程度的降低。降低原因是：要么反應不完全，要么VIB過量使自身聚集作用增大，從而導致體系ΔIRLS有所降低。故實驗用1.00×10-4mol/L VIB溶液3.00 mL來保障方法有高的靈敏度。

圖2 pH值對ΔIRLS的影響Fig.2 Effect of buffer pH on ΔIRLS

圖3 維多利亞藍B溶液濃度對ΔIRLS的影響Fig.3 Effect of victoria blue B concentration on ΔIRLS

2.2.3 試劑加入順序的影響室溫下，改變反應體系中試劑的加入順序，考察其對ΔIRLS的影響。實驗表明，靈敏度相對較高時，試劑加入順序為：Tris-HCl溶液、ATN溶液、VIB溶液，反應體系的ΔIRLS相對最大。

2.2.4 反應速度及RLS強度的穩定性室溫下，改變反應體系中ATN和VIB溶液的反應時間，考察其對ΔIRLS的影響。實驗表明，ATN和VIB的反應5 min即可完成，穩定時間至少1 h。實驗選在5 min后測定。

2.3 共存物質的影響

圖4 標準曲線Fig.4 Calibration curve

2.4 ATN濃度與ΔIRLS的關系

在選定的最佳實驗條件下，按實驗方法配制ATN標準系列溶液，掃描RLS光譜。作ATN的工作曲線(ΔIRLS-c曲線)，如圖4所示。反應體系的ΔIRLS與ATN的質量濃度在0.003～0.52 mg/L范圍內呈良好的線性關系，線性回歸方程為:ΔIRLS=-7.236+625.6c(mg/L)，相關系數r=0.9988，檢出限(3Sb/S)為0.0023 mg/L，可見方法有較寬的線性范圍及很高的靈敏度。

2.5 樣品分析

2.5.1 樣液的制備取重慶某藥業股份有限公司和山西某藥業有限公司生產的注射用ATN各1支(分別編為1#和2#)，將全部內容物分別置于小燒杯中，加少許甲醇攪拌，待ATN溶解后，轉入1 000 mL容量瓶中，加水定容。取1#和2#定容液各5.00 mL，分別用水稀至1 000 mL，即為1#和2#待測液。取健康人體新鮮尿液(編為3#)適量，過濾后稀釋10倍，即得待測液。

2.5.2 樣液的測定及回收試驗取1#待測液0.50 mL，2#待測液0.20 mL，3#待測液2.00 mL，分別按實驗方法測定各樣品中ATN的含量(各平行測定5份)。再做3種不同加標梯度的回收試驗(各梯度平行測定5份)，結果見表1。

表1 樣品分析結果及回收試驗(n=5)

ND：notdetected.

3 結論

用共振光散射技術測定ATN的含量具有高靈敏度和高選擇性，較寬線性范圍，較高準確度和精密度；所用儀器只需一般的熒光分光光度計，易于普及，所需藥品為一般常用試劑，分析成本低。該方法適于藥物及人體尿液中ATN含量的定量分析。