分散液液微萃取-高效液相色譜法同時測定大棗中白樺脂酸、齊墩果酸及熊果酸

崔毅軒， 劉 迪， 周齊齊， 高敬林， 馬海艷， 李夢嬌， 蔣 曄

(河北醫科大學藥學院，河北石家莊 050017)

大棗為鼠李科植物棗的成熟果實，其色澤優美香甜可口，不僅具有極高的營養價值，還是一味常用中藥[1 - 2]。大棗作為一味傳統中藥具有多種保健治療作用。現代藥理研究發現，大棗中含有的白樺脂酸(BA)、齊墩果酸(OA)、熊果酸(UA)等對多種疾病都具有較好的治療效果[3 - 4]。因此，同時測定上述三種成分對大棗的質量控制具有積極的意義。目前大棗中BA、OA及UA同時測定的方法主要采用85%乙醇超聲提取后高效液相色譜法(HPLC)分析[5]。但大棗的乙醇提取液基質復雜，造成目標峰與雜峰分離困難。為了減小大棗中的基質干擾，有報道在樣品經乙醇提取后，采用固相萃取小柱對樣品進行純化[6]，該方法雖然減小了基質干擾，但是處理過程繁瑣、費時，且需要消耗大量有機試劑。

分散液液微萃取(DLLME)是一種新型微型樣品前處理技術，該技術簡單快速、綠色環保[7]。本實驗采用DLLME技術，針對大棗樣品，優化了萃取劑種類及體積，水的加入量及萃取時間等前處理條件，建立了DLLME結合HPLC法同時測定大棗中的BA、OA及UA含量的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UltiMate 3000液相色譜儀(美國，賽默飛公司)；KQ5200E超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)；H1650臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發公司)；XW-80A渦旋混合器(上海醫科大學儀器廠)；Sartorius BP211D電子天平(上海耀壯檢測儀器設備有限公司)。

白樺脂酸(BA)對照品(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)，齊墩果酸(OA)對照品(純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所)，熊果酸(UA)對照品(純度為94.7%，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇、異丙醇為色譜純，其它試劑均為分析純。水為超純水。

大棗購買于國藥樂仁堂河北藥業有限公司。

1.2 溶液制備

1.2.1 對照品溶液分別精密稱取BA對照品10.10 mg，OA對照品10.14 mg，UA對照品10.12 mg，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得到濃度為1.01 mg·mL-1單標準儲備液。取各儲備液用甲醇逐級稀釋配制成BA濃度為20.2、50.5、101、152、202、252、303 μg·mL-1，OA和UA濃度均為10.1、25.2、50.5、75.8、101、126、152 μg·mL-1的系列混合對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液取大棗粉末約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加20 mL甲醇超聲30 min，轉移至50 mL離心管中，在10 000 r·min-1的轉速下，離心5 min，取上清液，殘渣同法操作，得上清液，合并上清液，旋蒸至近干，用甲醇復溶殘渣并轉移至5 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻。精密吸取溶液1 mL于10 mL離心管中，加1 mL氯仿和3 mL水，渦旋2 min混勻，在10 000 r·min-1轉速下，離心5 min，吸取氯仿層，氮吹至干，加甲醇定容至1 mL，混勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Innoval C18柱(150×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-異丙醇-0.1%磷酸溶液(含10 mmol·mL-1β-環糊精)(78∶2∶20,V/V/V)；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：210 nm；進樣量：20 μL。

2 結果與討論

2.1 提取純化方法選擇

現有方法多采用乙醇對OA與UA進行提取[8 - 9]，由于BA、OA與UA在甲醇中也有較好的溶解度，因此選擇甲醇作為提取溶劑。但是直接經甲醇提取進樣雜質過多而影響BA、OA與UA的測定，故本實驗最終選擇DLLME法對提取液進行純化。目前未見將DLLME應用于大棗中有效成分分析的報道。本文選氯仿為萃取劑，在萃取系統中加入水促進氯仿和甲醇溶液分層。通過渦旋可使三種溶劑充分混合并霧化，從而快速達到萃取平衡，完成對樣品的萃取與純化。結果顯示(圖1)，本方法能夠大大純化樣品并減少了雜質峰對目標峰的干擾。并且有機溶劑用量少，反應迅速，純化效果良好。

2.2 萃取條件的優化

2.2.1 萃取劑的選擇及用量由于BA、OA與UA在乙酸乙酯與氯仿中均有較好的溶解度，因此本方法以乙酸乙酯與氯仿作為備選萃取劑進行考察，結果表明(圖2)，當萃取劑為氯仿時，BA、OA與UA的萃取效果更好，因此選擇氯仿作為萃取溶劑。對氯仿的用量進行了考察，結果表明見圖3，當氯仿用量為1 mL時，萃取達到完全，因此選擇萃取劑用量為1 mL。

2.2.2 水的作用及加入量考察在本實驗中，甲醇為待測物的溶劑，但是甲醇與氯仿具有一定的相溶性，會造成萃取不完全，并將雜質引入到氯仿層中。因此在體系中考慮加入水以增大甲醇層的極性，促使甲醇溶液與氯仿分層，并除去一些極性大的水溶性雜質，有助于對待測物進行純化。考察了水的加入量，結果表明(圖4)，當水加入量為3 mL時，萃取效果最佳，因此選擇水的加入量為3 mL。

2.2.3 萃取時間的選擇考察了萃取時間，結果表明(圖5)，當渦旋萃取時間為2 min時，萃取達到完全，繼續增加萃取時間會降低萃取效率，這可能是由于過長時間的萃取會使待測物重新溶解到水相中，從而影響萃取效果，因此選擇萃取時間為2 min。

圖2 萃取劑的選擇Fig.2 Selection of extractant

圖3 萃取劑體積的優化Fig.3 Optimization of extractant volume

圖4 水的加入量的優化Fig.4 Optimization of the amount of water added

圖5 萃取時間的優化Fig.5 Optimization of extraction time

2.3 色譜流動相的選擇

本實驗對不同的流動相系統：甲醇-0.2%HAc溶液[6]、甲醇-水[10]以及乙腈-水[11]等進行了考察，但是均不能將OA和UA分離。有文獻指出β-環糊精具有超分子配位能力，常用于對同分異構體進行分離[12 - 14]。因此在流動相中加入了β-環糊精來改善OA與UA的分離。同時，在實驗中發現目標峰的保留時間較長，不利于快速分析。因此在流動相中加入異丙醇、H3PO4等較強的洗脫溶劑來縮短分析時間，最終確定流動相條件為甲醇-異丙醇-0.1%H3PO4溶液(含10 mmol ·L-1β-環糊精)(78∶2∶20,V/V/V)。

2.4 方法學驗證

圖6 系統適用性與專屬性試驗Fig.6 System adaptability and specificity test

2.4.1 系統適應性與專屬性試驗分別取空白溶液(甲醇)，混合對照品溶液(BA：152 μg·mL-1，OA：75.8 μg·mL-1，UA：75.8 μg·mL-1)，供試品溶液各20 μL，進行色譜分析，結果見圖6。分析可知，BA、OA及UA分離良好(分離度RS>1.5)，樣品中其他成分對BA、OA和UA的測定沒有干擾，該方法專屬性良好。

2.4.2 線性范圍分別吸取混合對照品溶液各20 μL進行分析，以峰面積(A)為縱坐標，BA、OA、UA溶液的濃度(c)為橫坐標，繪制標準曲線，得到BA的線性回歸方程為：A=0.101c+0.276(r=0.999)，OA的線性回歸方程為：A=0.137c+0.106(r=0.993)，UA的線性回歸方程為：A=1.37c+0.124(r=0.999)。結果表明，BA在20.2～303 μg·mL-1范圍內線性關系良好，OA和UA均在10.1～152 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.4.3 定量限與檢測限移取BA、OA、UA的系列單一對照品溶液進樣分析，以信噪比(S/N)=10和S/N=3時，分別測得BA、OA、UA的定量限與檢測限。結果表明，BA的定量限為20.2 μg·mL-1，檢測限為6.67 μg·mL-1；OA的定量限為5.05 μg·mL-1，檢測限為1.68 μg·mL-1；UA的定量限為5.05 μg·mL-1，檢測限為1.68 μg·mL-1。

2.4.4 精密度吸取152 μg·mL-1BA、75.8 μg·mL-1OA和75.8 μg·mL-1UA的混合對照品溶液注入高效液相色譜儀，重復進樣6次，BA峰面積相對標準偏差(RSD)為0.5%，OA峰面積RSD為1.0%，UA峰面積RSD為0.9%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 重復性取大棗粉末6份，每份約2 g，精密稱定，按1.2.2過程處理，按1.3條件測定含量，BA峰面積RSD為1.2%，OA峰面積RSD為1.5%，UA峰面積RSD為1.4%，結果表明，該方法重復性良好。

2.4.6 耐用性考察在選定色譜條件下，分別取混合對照溶液和供試品溶液各20 μL，改變流動相流速分別為0.7 mL·min-1、0.8 mL·min-1、0.9 mL·min-1對其進行測定；使用不同色譜柱Innoval C18(150×4.6 mm,5 μm)，Welch Ultimate C18(150×4.6 mm,5 μm)，Phenomenex C18(150×4.6 mm,5 μm)對其進行測定，結果表明不同流速以及不同廠家的同類色譜柱對BA、OA與UA的測定沒有顯著影響，說明本方法耐用性良好。

2.4.7 加樣回收率取大棗粉末5份，每份約1 g，精密稱定，分別加304 μg BA、152 μg OA和152 μg UA，混勻晾干后按1.2.2過程處理，按1.3條件測定，記錄峰面積，分別將峰面積帶入各自的線性方程，得出測得量并計算得平均回收率，結果表明本方法回收率較好，方法準確度高(表1)。

表1 白樺脂酸、齊墩果酸及熊果酸的加樣回收率

2.4.8 樣品測定取三批大棗粉末各一份(批號：17051001，17051209，17073048)，每份約2 g，精密稱定，按1.2.2處理得樣品溶液，每個樣品重復進樣3次，將所得BA、OA和UA的峰面積分別代入回歸方程，求得各自的濃度與含量，結果見表2。

表2 樣品測定結果(n=3)

3 結論

本實驗通過DLLME步驟，極大地降低了大棗中的基質干擾，同時結合HPLC法完成了對大棗中BA、OA與UA的含量測定。該方法重復性高，精密度良好，可用于大棗中上述三種成分的準確測定，為大棗的質量控制提供了新的方法與思路。