基于核酸適配體-聚多巴胺納米復(fù)合物的熒光生物傳感器檢測(cè)赭曲霉素A

張立轉(zhuǎn)， 趙旭華， 梁晶晶， 崔小華， 翟 翔， 王玉瑤， 于保鋒

(山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西太原 030001)

赭曲霉素A(Ochratoxin A，OTA)是一類分布較廣的真菌毒素，主要由曲霉菌屬和青霉菌屬代謝生成。作為一種常見的食品污染物，OTA廣泛存在于谷類、豆類、咖啡、葡萄酒、啤酒和奶制品等[1 - 3]中。研究表明，OTA對(duì)大多數(shù)哺乳動(dòng)物具有很強(qiáng)的肝毒性、腎毒性以及免疫學(xué)毒性，已經(jīng)被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)定義為人類可能的致癌物[4 - 5]。目前OTA的測(cè)定方法有高效液相色譜法(HPLC)[6 - 7]和薄層層析法(TLC)[8]等。上述方法雖然可以準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)OTA，但大都存在所用儀器昂貴、前處理復(fù)雜、耗時(shí)且不能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等缺點(diǎn)。酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)也可用于OTA的測(cè)定，但所用抗體的制備必須依賴于動(dòng)物或細(xì)胞，成本較高、穩(wěn)定性差[9 - 10]。因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速且靈敏的OTA檢測(cè)方法有著非常重要的意義。

核酸適配體(Aptamer)是一類能夠和各種目標(biāo)物進(jìn)行高親和力、高特異性識(shí)別的單鏈DNA或RNA分子，它可以通過體外篩選的方法從隨機(jī)核酸文庫(kù)中獲得[11 - 12]。與抗體相比，核酸適配體具有識(shí)別分子范圍廣、化學(xué)合成與修飾簡(jiǎn)單，以及穩(wěn)定性高等多種優(yōu)點(diǎn)[13 - 15]。因此，核酸適配體的出現(xiàn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)抗體的不足，并作為一種常見分子識(shí)別元件被廣泛用于生物傳感分析中[16 - 19]。

聚多巴胺納米顆粒(Polydopamine Nanospheres，PDANPs)是一種新型的納米材料，它由若干個(gè)多巴胺分子聚合而成，其合成過程簡(jiǎn)單、成本低[20 - 21]。該材料還具有良好的水溶性和生物相容性，并且可通過π-π堆積作用吸附單鏈DNA分子[22]。此外，研究表明PDANPs是一種廣譜猝滅劑且具有很高的熒光猝滅能力[23]。因此，將PDANPs作為熒光猝滅劑可以有效減少傳統(tǒng)分子信標(biāo)對(duì)熒光團(tuán)-猝滅團(tuán)的選擇并增加探針的信背比?；赑DANPs的上述優(yōu)點(diǎn)，研究者設(shè)計(jì)了多種熒光傳感體系用于DNA、蛋白質(zhì)和小分子的測(cè)定[22 - 24]。然而將PDANPs用于食品中OTA的檢測(cè)卻鮮有報(bào)道。

本研究利用核酸適配體-PDANPs復(fù)合物，構(gòu)建了一種新型的熒光生物傳感器用于定量測(cè)定OTA。PDANPs高的熒光猝滅效率以及核酸適配體特異性的識(shí)別能力使該傳感器具有良好的靈敏度與選擇性。此外，該傳感器設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、反應(yīng)速度快并且可用于紅酒中OTA的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

JSM-7001F熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本，JEOL公司)；MOS -500圓二色譜光譜儀(法國(guó)，Bio-Logic公司)；FTIR-640傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)，Varian公司)；RF-6000熒光分光光度計(jì)(日本，島津公司)。

鹽酸多巴胺、赭曲霉素A(OTA)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，黃曲霉素B1(AF B1)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone)和華法林(Warfarin)(北京百靈威公司)、NaCl、CaCl2以及其它試劑(北京索萊寶公司)，OTA的核酸適配體(5′-FAM-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3′)由上海生工公司合成。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PDANPs的制備參照文獻(xiàn)方法[23]合成PDANPs。具體合成過程如下：在100 mL Tris緩沖溶液(10 mmol/L，pH=7.4)和40 mL異丙醇的混合溶液中，加入100 mg鹽酸多巴胺，室溫下攪拌反應(yīng)72 h。反應(yīng)結(jié)束后，將懸浮液離心，獲得的沉淀用超純水洗滌數(shù)次。最后將沉淀冷凍干燥以備進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 OTA的檢測(cè)OTA的檢測(cè)需要在100 μL的Tris-HCl緩沖溶液(10 mmol/L Tris，120 mmol/L NaCl和20 mmol/L CaCl2,pH=8.0)中進(jìn)行。先將OTA核酸適配體探針(100 nmol/L)與不同濃度的OTA溶液混合反應(yīng)30 min，然后將PDANPs加入到樣品溶液中反應(yīng)10 min，最后測(cè)量并記錄樣品溶液在波長(zhǎng)518 nm處的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 PDANPs的形貌及光譜表征

利用掃描電鏡(SEM)來表征PDANPs的形貌和尺寸。從圖1(A)可觀察到制備的PDANPs基本呈球形，且平均直徑為190 nm。圖1(B)是多巴胺和PDANPs的紅外光譜圖，在1 040、1 506 cm-1處出現(xiàn)了多巴胺聚合之后的特征峰，其中1 040 cm-1處為PDANPs材料上C-H鍵面內(nèi)的彎曲振動(dòng)峰，而1 506 cm-1處則為吲哚-5,6-醌的C-N鍵上較弱的彎曲振動(dòng)峰，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[22]一致。

圖1 (A)PDANPs的掃描電鏡(SEM)圖；(B)多巴胺(a)和PDANPs(b)的紅外(IR)光譜圖Fig.1 (A) SEM image of PDANPs;(B) IR spectra of dopamine(a) and PDANPs(b)

2.2 實(shí)驗(yàn)原理

圖2 新型熒光生物傳感器用于OTA檢測(cè)的設(shè)計(jì)原理圖Fig.2 Schematic illustration of the OTA fluorescence biosensor

本研究構(gòu)建的熒光生物傳感器用于OTA檢測(cè)的設(shè)計(jì)策略如圖2所示，可特異性識(shí)別OTA的核酸適配體(Aptamer)的5′末端標(biāo)記有熒光團(tuán)(FAM)。當(dāng)沒有OTA存在時(shí)，處于單鏈狀態(tài)的核酸適配體可通過較強(qiáng)的π-π堆積作用吸附于PDANPs表面，使得FAM與PDANPs之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，故FAM的熒光被猝滅。加入目標(biāo)物OTA之后，OTA與其核酸適配體特異性識(shí)別并結(jié)合，使核酸適配體從單鏈狀態(tài)折疊為穩(wěn)定的G -四鏈體結(jié)構(gòu)。由于G -四鏈體與PDANPs之間的結(jié)合能力弱，導(dǎo)致FAM的猝滅作用減弱，傳感體系的熒光增強(qiáng)。這為OTA的定量檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便的手段和依據(jù)。

2.3 實(shí)驗(yàn)可行性分析

為了評(píng)估PDANPs的熒光猝滅能力，將核酸適配體探針和不同濃度的PDANPs混合并記錄其熒光信號(hào)的變化。如圖3(A)所示，隨著PDANPs濃度的逐漸增大，核酸適配體探針上熒光團(tuán)的熒光被逐漸猝滅，并且當(dāng)PDANPs的濃度達(dá)到0.4 mg/mL時(shí)，其熒光幾乎被猝滅至基線水平，此時(shí)PDANPs的熒光猝滅效率為96.8%。該結(jié)果表明PDANPs能夠吸附核酸適配體分子并且具有很高的熒光猝滅能力。圖3(B)為PDANPs對(duì)未修飾核酸適配體熒光素的熒光影響情況，當(dāng)加入0.4 mg/mL PDANPs時(shí)熒光素的熒光有所降低，說明熒光素與PDANPs之間有一定的非特異性吸附。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的可行性，采用圓二色譜分析加入OTA前后核酸適配體構(gòu)象的變化情況，結(jié)果如圖4所示。加入OTA之前，核酸適配體探針以隨機(jī)狀態(tài)存在，加入OTA后，觀察到圓二色譜圖上290 nm的位置出現(xiàn)很強(qiáng)的正峰，而在265 nm的位置出現(xiàn)微弱的負(fù)峰，這與相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道一致，表明核酸適配體探針與OTA形成了反向平行的G -四鏈體結(jié)構(gòu)[16]。

圖3 (A) PDANPs熒光猝滅能力的考察;(B)PDANPs(0.4 mg/mL)對(duì)熒光素FAM熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 (A)Fluorescence quenching efficiency of aptamer(100 nmol/L) with different concentrations of PDANPs(from top to bottom:0,0.05,0.1,0.15,0.2,0.3 and 0.4 mg/mL);(B)The effect of PDANPs(0.4 mg/mL) on the fluorescence intensity of fluorescein(1 μmol/L)

圖4 加入OTA(100 μmol/L)前后核酸適配體探針的圓二色譜(CD)圖Fig.4 CD spectra of aptamer(10 μmol/L) in the absence(red) and presence(black) of OTA

圖5 PDANPs的濃度(A)和pH值(B)對(duì)傳感器體系熒光強(qiáng)度比的影響Fig.5 The effect of PDANPs concentration(A) and pH(B) on the fluorescence intensity ratio(F/F0) of the sensing systemThe concentration of OTA was 500 nmol/L.

2.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)最佳的傳感性能，對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)參數(shù)(PDANPs的濃度和pH值)進(jìn)行了優(yōu)化。如圖5(A)所示，隨著PDANPs濃度的增加，傳感器體系的熒光強(qiáng)度比值(F/F0)顯著增加；然而當(dāng)PDANPs的濃度大于0.3 mg/mL時(shí)，F(xiàn)/F0逐漸下降，可能原因是高濃度的PDANPs對(duì)G -四鏈體標(biāo)記的FAM有過度的猝滅效應(yīng)。故選擇0.3 mg/mL的PDANPs作為最佳加入量?？疾炝藀H值對(duì)傳感器響應(yīng)性能的影響，從圖5(B)中同時(shí)可以觀察到當(dāng)pH值為8.5時(shí)，該傳感體系的F/F0最高。其可能原因是pH值為8.5時(shí)目標(biāo)物OTA與其核酸適配體的結(jié)合能力最強(qiáng)，因此選擇緩沖液的pH值為8.5。

2.5 傳感器的靈敏度分析

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，OTA濃度為0～20 μmol/L時(shí)，將構(gòu)建的傳感器用于OTA的測(cè)定。隨著OTA濃度的增加，傳感器的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。由于PDANPs和OTA與其核酸適配體形成的G -四鏈體之間仍存在一定的吸附能力，所以熒光最大增強(qiáng)倍數(shù)為3.5倍。該傳感器的校正曲線如圖6所示，其動(dòng)力學(xué)響應(yīng)范圍為30 nmol/L～1 μmol/L(R2= 0.991)，檢出限(3σ)是20 nmol/L，與其它傳感器相比，動(dòng)力學(xué)響應(yīng)范圍增加，靈敏度有所提高[25]。該傳感器獲得較高靈敏度的主要原因是PDANPs高的熒光猝滅能力使傳感器具有很低的熒光背景值。

2.6 傳感器的特異性分析

考察所構(gòu)建傳感器對(duì)500 nmol/L OTA以及1 μmol/L其它霉菌毒素(AF B1、Zearalenone、Warfarin)的熒光響應(yīng)。如圖7所示，OTA的加入使傳感器的熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，而相同條件下其它霉菌毒素的加入對(duì)傳感體系的熒光信號(hào)基本無影響。

圖6 傳感器探測(cè)OTA的校正曲線(插圖為傳感器對(duì)低濃度OTA的響應(yīng)情況)Fig.6 Calibration curve for OTA detection(Inset:the biosensor responses to low concentrations of OTA)

圖7 傳感器特異性的考察(OTA的濃度為500 nmol/L，其它霉菌毒素的濃度為1 μmol/L)Fig.7 Selectivity test for OTA(The concentration of OTA was 500 nmol/L,and the concentrations of other tested mycotoxins were 1 μmol/L)

2.7 紅酒中OTA的分析

為了評(píng)估該傳感器在實(shí)際樣品中的分析應(yīng)用能力，首先將紅酒稀釋100倍，然后將不同濃度的OTA (200 nmol/L、500 nmol/L、1 μmol/L)分別加入到稀釋后的紅酒樣品中，并對(duì)其進(jìn)行熒光測(cè)定，每組實(shí)驗(yàn)結(jié)果是3次實(shí)驗(yàn)的平均值。如表1所示，該傳感器對(duì)OTA回收率為96%～105%，表明該傳感器可用于紅酒中OTA的檢測(cè)。

表1 紅酒中OTA的回收率實(shí)驗(yàn)

aMeanofthreedeterminations;bSD:standarddeviation.

3 結(jié)論

本研究利用PDANPs高效的熒光猝滅能力，以及核酸適配體特異性的識(shí)別能力，構(gòu)建了一種新型的熒光生物傳感器用于OTA的定量檢測(cè)。該傳感器設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、成本低廉、反應(yīng)速度快，且具有良好的選擇性和靈敏度，其檢出限為20 nmol/L。該傳感器還可用于紅酒中OTA的測(cè)定，回收率在96%～105%之間。