氣相色譜-質譜的代謝組學方法研究血必凈注射液對百草枯中毒大鼠的治療作用

李 莎， 祝益民， 劉 文*,， 伍洋科， 蔣菲婭， 顏 笑

(1.湖南師范大學醫學院，湖南長沙 410013；2.湖南省人民醫院藥學部，湖南長沙 410005；3.危急重癥代謝組學湖南省重點實驗室，湖南長沙 410005)

百草枯(Paraquat，PQ)是在農業生產中廣泛應用的非選擇性、接觸性、低污染、低殘留的一種廣譜高效除草劑。它不僅對植物有毒，對人類和動物也有很大的毒性[1 - 2]。攝入超過20 mL的20%PQ水劑會導致全身炎癥反應、多器官衰竭和心源性休克而致死；攝入較小的劑量也會導致死亡，但過程較慢可能需要數周時間，并且由過度和不可逆轉的肺纖維化和腎衰竭發生而致死[3]。PQ患者中毒后會累及多器官損傷，其中肺是百草枯的主要毒性靶標；PQ中毒引起的肺損傷最初表現為急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征，隨后發展為廣泛的纖維化[4]。目前臨床上主要治療手段是血液灌注、血液透析，合用免疫調節、抗氧化治療[5]，但是由于百草枯固有的毒性以及缺乏特效解毒劑，其預后致死率依然很高。

血必凈注射液(XBJ)是一種從赤芍、川芎、丹參、紅花和當歸5味中草藥中提取的中藥制劑，它具有清除氧自由基、保護血管內皮、抗炎性介質、拮抗內毒素等作用，主要用于治療與炎癥有關的間質性疾病[6]。血必凈聯合血液灌注治療百草枯中毒有助于改善患者器官功能障礙并阻止肺纖維化的發生，從而降低死亡率[7]，這在一定程度上表明當機體暴露于百草枯后，血必凈注射液聯合其他治療手段可以對機體起到一定的保護作用，但并不能直觀、全面的評價血必凈的治療效果。

代謝組學(Metabolomics)作為系統生物學研究的前沿技術和方法，通過識別生命系統中全部生物化學變化的代謝特征，為我們提供了一個了解疾病和藥物作用的新視角，可以從更全面、直觀的角度來評價藥物的治療作用[8]。而氣相色譜-質譜(GC-MS)是代謝組學應用于非靶向代謝組學的常規技術，具有分離效果好、靈敏度高、易于定性定量[9 - 10]。本研究采用GC-MS代謝組學方法來探索血必凈注射液對百草枯中毒大鼠肺損傷的治療效果和代謝影響。研究發現，百草枯中毒大鼠肺組織發生了明顯的病理改變，百草枯中毒大鼠相比于正常大鼠，其血漿中內源性代謝物變化最顯著的有7種，L-纈氨酸、琥珀酸、D -半乳糖、亞油酸、L-色氨酸5種的含量相對增加，而D -果糖、麥芽糖2種的含量則降低。血必凈注射治療后可對5種生物標志物含量進行回調，從而達到對抗百草枯毒性反應的作用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Aglient 7890A-5975C型氣相色譜-質譜聯用儀(美國，安捷倫公司)，Aglient MSD ChemStation工作站和NIST 14質譜庫；5415R高速離心機(Eppendorf Centrifuge公司)；MX-F漩渦混合器(美國，SCILOGEX公司)。

20%PQ溶液(先正達南通作物保護有限公司)；血必凈注射液(天津紅日藥業股份有限公司)；甲醇(色譜純，美國Sigma公司)；N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，內含1%TMCS)(美國AccuStandard公司)；O-甲基羥胺鹽酸鹽、脯氨酸、草酸、棕櫚酸、葡萄糖、膽固醇均購自北京百靈威科技有限公司；吡啶、2-異丙基蘋果酸購自美國Sigma公司。

1.2 實驗動物及處置

SD雄性大鼠36只，體重200～220 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(許可證：SCXK(湘)2016-0002)，飼養于湖南省人民醫院實驗動物中心動物實驗室。按隨機數字表法分為對照組、PQ組、血必凈干預組三組，然后將每組再分為1 d、7 d亞組，每組6只。對照組灌胃1 mL生理鹽水；PQ組一次性灌胃40 mg/kg[11 - 12]PQ染毒；血必凈組于灌胃2 h后尾靜脈注射血必凈注射液8 mL/(kg·d)[13]；對照組和PQ組尾靜脈注射等量生理鹽水。均給藥7 d，每日觀察大鼠活動情況。本實驗動物處置方法均符合動物倫理學標準。

1.3 樣本收集

于末次給藥干預后的第2 d用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠，收集心臟血并離心，提取上清液分裝成每管200 μL至1.5 mL離心管中，于-80 ℃儲存直至后續實驗分析。開胸取出雙側肺組織，將右側下葉組織浸泡于10%的中性甲醛中用于蘇木精-伊紅(HE)染色；其余肺組織分別裝于1.5 mL EP管中速凍于液氮中，然后-80 ℃儲存直至后續實驗分析。

1.4 HE染色

將肺組織在10%的中性福爾馬林中固定48 h，包埋在石蠟中并切成3 μm切片。使用標準方案進行HE染色后，在光學顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.5 樣本處理

按照文獻方法[14]進一步優化樣品前處理步驟。取200 μL血漿樣本于4 ℃解凍后，每份加入20 μL異丙基蘋果酸-甲醇溶液(內標，1 mg/mL)，渦旋20 s，加入600 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋20 s，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min，取上清液置于10 mL玻璃離心管中，常溫下氮氣吹干后，加入100 μL甲氧胺-吡啶溶液(20 mg/mL)，渦旋45 s，70 ℃水浴肟化1 h；加入100 μL硅烷化試劑N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，內含1%TMCS)，渦旋45 s，70 ℃水浴1 h，冷卻至室溫，取100 μL于200 μL內襯管的進樣小瓶中，用于GC-MS 分析，進樣量1 μL。

1.6 GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為安捷倫HP-5MS熔融石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；采用程序升溫的方式以70 ℃作為起始溫度，保持2 min后，以8 ℃/min的速率升至140 ℃，然后以5 ℃/min的速率升至240 ℃，再以10 ℃/min的速率升至280 ℃，保持2 min；分流比：10∶1；柱流速：1 mL/min；進樣口溫度：280 ℃；載氣為氦氣。

質譜條件：EI離子源溫度250 ℃；電離能量70 eV；接口溫度270 ℃；掃描模式：全掃描，(m/z12～400)；掃描間隔 0.2 s；溶劑切除時間為5 min。

1.7 分析方法驗證和質量控制(QC)

為了確保樣本分析的精確性和可重復性，本實驗采用了混合5個標準品用于樣品制備過程和儀器穩定性測試。此外將所有樣品等體積血漿(200 μL)制備合并的QC樣品，將這些QC樣品與研究樣品一起分析[15 - 16]。在研究樣品序列之前先連續注3針QC樣品評估儀器穩定性，每6個研究樣品注射1個QC樣品評估重復性。

1.8 數據處理

使用Aglient MSD chemstation工作站對GC-MS總離子流圖中的各種代謝物的峰面積進行積分，以相對峰面積(目標物與內標2-異丙基蘋果酸峰面積之比)表示代謝物的相對含量；利用NIST數據庫對血漿中的代謝物進行鑒定，得到GC-MS數據；使用化學計量學方法進行多元數據分析，得到差異代謝物。

2 結果與討論

2.1 血必凈注射液對百草枯誘導的病理變化

如圖1所示，對照組的肺組織顯示無明顯病理變化，相反在PQ組的肺中，呈現了廣泛的形態學肺損傷，例如間質水腫，肺泡出血，且隨時間變化呈現肺泡壁增厚，炎性細胞浸潤，甚至組織破壞。然而，用血必凈處理后可減弱肺中PQ誘導的病理損傷(血必凈組)。

圖1 血必凈對百草枯誘導的病理變化Fig.1 Pathological changes of paraquat induced by XuebijingA-1 d；B:7 d(HE×200).

2.2 代謝組學分析

2.2.1 方法學考察本研究采用混合標準品來考察儀器系統的穩定性，包括有機酸(草酸)、氨基酸(脯氨酸)、糖類(葡萄糖)、脂肪酸(棕櫚酸)及膽固醇，結果見表1。從表中可看出，其中4種標準品的相對標準偏差(RSD)均小于3%，膽固醇的RSD也小于15%。說明實驗過程中的誤差在可接受范圍之內，儀器穩定性也良好。本研究同時采用QC樣本對實驗穩定性和重復性進行考察，其結果顯示QC樣本中50個代謝物中大部分物質在肟化-硅烷化條件下表現出良好的重復性和穩定性(RSD <20%)，符合方法學的要求。

表1 各標準物質的RSD(n=5)

圖2 不同組別的總離子流(TIC)色譜圖Fig.2 TIC chromatograms of different groups*chromatographic peaks attribution are shrown in Table 2.

2.2.2 代謝圖譜解析圖2是不同組別的總離子流(TIC)色譜圖，從圖中可以看出不同組別之間的差異。本實驗通過NIST標準質譜庫和標準品對大鼠血漿中的代謝物進行定性分析，共分辨出62個色譜峰，鑒定出氨基酸、糖類、脂肪酸、有機酸等50種代謝物質，結果見表2。并通過代謝物質與內標峰面積之比進行相對定量分析，結果顯示三組大鼠血漿代謝物質基本相同，但其含量存在差異。

表2 GC-MS檢測到的大鼠內源性物質

圖3 不同組大鼠血漿的PCA-3D圖Fig.3 PCA-3D diagram of plasma in different groups of ratsA:1 d;B:7 d.

2.2.3 化學計量學分析本文采用主成分分析法(PCA)對各組大鼠的代謝信息進行分析，結果如圖3所示。經治療后第1 d，PQ組與血必凈干預組并未能達到很好的分離，說明在血必凈干預1 d后其治療效果并不明顯(圖3A)；經治療7 d后，PQ組與血必凈組能得到較佳的分離效果，且血必凈組遠離模型組，向正常對照組靠近，表明在給藥后7 d血必凈表現出一定的抗PQ中毒效果(圖3B)。為了進一步分析其差異代謝物，運用SMICA 13.0軟件對第7 d的數據進行變量重要性投影分析(VIP)，得到VIP值大于1.0的20種代謝物，并將對照組與PQ組的這20種代謝物進行t-test分析，得到有統計學意義的7種代謝物，其結果見表3。

表3 差異性代謝物的統計分析結果(n=6)

Note:↑forincrease；↓fordecrease；*forp<0.05；**forp<0.01；/forp>0.05.

從表3可見，百草枯中毒大鼠相比于對照組，其血漿中內源性代謝物變化最顯著的有7種，L-纈氨酸、琥珀酸、D -半乳糖、亞油酸、L-色氨酸5種的含量在百草枯中毒組增加，而D -果糖、麥芽糖2種的含量則下降，這與文獻報道[17]的大致相似。L-纈氨酸、琥珀酸、L-纈氨酸是蛋白質和脂肪的代謝產物，亞油酸是人體營養中必需的脂肪酸，而D -半乳糖是一種提供能量的營養素，D -果糖、麥芽糖是糖代謝的產物，這表明百草枯中毒后蛋白質和脂肪的代謝作用增強，脂肪酸代謝增強，而能量代謝減弱。用血必凈注射液治療后，大鼠血漿中L-纈氨酸、琥珀酸、D -半乳糖、亞油酸、L-色氨酸的含量得到回調，與對照組無明顯差異，說明血必凈注射液通過調節體內部分氨基酸代謝、脂肪酸代謝和能量代謝對抗百草枯的毒性反應。

3 結論

在本研究中，使用基于GC-MS的代謝組學技術和化學計量學分析，在對照組與百草枯組之間鑒定出7種差異代謝物，這些生物標志物調節能量代謝、氨基酸代謝、脂肪酸代謝和糖代謝。血必凈注射液可以通過逆轉代謝紊亂來減輕大鼠的肺損傷，并且初步確認了血必凈調節的5種生物標志物。該研究可以促進對百草枯中毒的發病機制的進一步理解，從而促進靶向篩選治療藥物。此外，闡明血必凈注射液對百草枯中毒的代謝調節作用，可為其在臨床實踐中的合理應用提供科學依據。