核殼式Ag@MIPs的制備及對氨芐西林的表面增強拉曼光譜檢測

李 軒, 李利軍*, 程 昊, 馮 軍, 徐婭娟, 李笑軒

(1.廣西科技大學生物與化學工程學院,廣西柳州 545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州 545006；3.廣西高校糖源加工重點實驗室，廣西柳州 545006)

氨芐西林(Ampicillin,AMP)，又稱氨芐青霉素，它是一種β-內酰胺類抗生素，可治療多種細菌感染。在飼養動物過程中，過量使用AMP將會造成其在蛋類、肉類等動物源性食品中殘留[1 - 2]，而長期食用這類食品會造成人體產生耐藥菌株，進而影響一些疾病的治療[3 - 4]。因此，發展快速、準確、靈敏的AMP檢測方法具有重要意義。目前，AMP的檢測方法主要有高效液相色譜法[5]、液-質聯用法[6]等，但這些方法或操作繁瑣耗時，或難以檢測復雜樣品。韓斯琴高娃等[7]以Al2O3陶瓷作襯底，利用Ag溶膠對AMP林拉曼光譜的增強效應，建立了AMP的表面增強拉曼光譜(SERS)定性檢測方法，但靈敏度較低，且未能選擇性檢測。拉曼光譜可實現對物質的無損、快速檢測[8]，而SERS可以克服常規拉曼光譜靈敏度較低的缺陷，極大增強被測物質的拉曼信號。目前，以貴重金屬納米粒子作為基底在SERS中應用較多，但穩定性較差且不具備特異識別功能[9]。分子印跡技術不僅可改善納米Ag基底的化學穩定性，并且具備特異識別性[10 - 13]。

表面粗糙程度較大的Ag基底具有較強的拉曼增強響應，并且拉曼增強效果集中在凸起和棱角部位[14 - 15]。本文通過抗壞血酸還原法合成表面類似毛線團的Ag微球，并以AMP為模板分子，丙基三甲氧基硅烷(MPS)為硅烷化試劑，丙烯酸(MAA)為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯劑，2,2-偶氮二異丁腈(AIBN)為引發劑，在Ag微球表面制備AMP分子印跡聚合物(Ag@MIPs)，采用激光共聚焦拉曼光譜儀(激發波長為638 nm)，以Ag@MIPs為基底對AMP進行檢測。結果表明，所制備的Ag@MIPs 具有較強的SERS效果，增強因子達3.79×105，對AMP的檢測限可達到1.0×10-8mol/L。同時，以Ag@MIPs為基底，對相同濃度的氨芐西林、阿莫西林和苯唑西林混合溶液進行特異性吸附試驗，結果表明Ag@MIPs對AMP具有較高的選擇性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Hitachi S-4800冷場發射掃描電子顯微鏡(日本，日立公司)；JEM 2100透射電子顯微鏡(日本，JEOL公司)；BrukerD8A A25 X射線衍射儀(德國，布魯克公司)；Frontier傅里葉紅外光譜儀(美國，Perkin Elmer公司)；XploRAPLUS激光共聚焦拉曼光譜儀(日本，Horiba公司)。

氨芐西林(AMP)、3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS，使用前經活性炭吸附處理以除去阻聚劑)購于上海麥克林生化科技有限公司；甲基丙烯酸(MAA)購于成都科隆化工試劑廠；2,2-偶氮二異丁腈(AIBN)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)購于美國阿拉丁工業公司；AgNO3、聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP)購于國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸購于廣東光華科技股份有限公司；無水乙醇購于西隴科學股份有限公司；乙腈購于天津市科密歐化學試劑有限公司。所用試劑均為分析純，水為超純水。

1.2 材料的制備

Ag微球的制備參考文獻方法[16]，并在其基礎上進行改進：取0.2 mL AgNO3溶液(1 mol/L)分散于10 mL PVP溶液(質量分數0.1%)中，磁力攪拌5 min。向上述溶液中迅速滴加2 mL 0.1 mol/L抗壞血酸溶液，反應10 min。產物用超純水與無水乙醇各洗滌3次后，置于真空烘箱中40 ℃干燥24 h，待用。

Ag@MPS的制備：取上述所得粒子400 mg分散于50 mL乙醇-水溶液(4∶1)中，超聲10 min，加入4 mL MPS，磁力攪拌5 min，充入N2后置于油浴中40 ℃反應24 h。離心分離得產物，分別用超純水與無水乙醇各洗滌3次，置于真空烘箱中40 ℃干燥24 h，備用。

Ag@MIPs的制備：稱取100 mg AMP，超聲分散于50 mL乙醇-乙腈(1∶1)中，加入100 μL MAA，磁力攪拌5 min。向上述溶液中加入150 mg Ag@MPS，超聲10 min，加入4 mL EGDMA，磁力攪拌10 min，然后加入1 mg AIBN，在N2保護下，60 ℃油浴反應24 h。將離心所得產物用乙酸-水溶液(4∶1)洗脫直至無AMP檢出。最后，分別用超純水與無水乙醇各洗滌3次，置于真空烘箱中40 ℃干燥24 h。

1.3 樣品的制備與拉曼光譜采集

分別取10 mg Ag微球和核殼式Ag@MIPs微球，加入1 mL不同濃度的AMP溶液或氨芐西林、阿莫西林和苯唑西林混合溶液，超聲10 min，滴到石英玻璃片上晾干，采集拉曼光譜。分別稱取不同劑型的AMP 4 mg，用10 mL超純水配制成溶液，然后分別取10 mg Ag@MIPs微球，加入1 mL不同劑型的AMP溶液，超聲10 min，滴到石英玻璃片上晾干，采集拉曼光譜。光譜參數為：波長為638 nm，積分時間為10 s，平均次數為1次。

2 結果與討論

2.1 Ag、Ag@MIPs的掃描電鏡和透射電鏡表征

圖1是Ag微球、Ag@MIPs的掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖。從圖1a可以看出，該方法制備的Ag微球表面類似毛線團。對比圖1b和1c不難看出Ag微球表面包裹了一層透光度較高的薄膜，可初步確定在Ag微球的表面包覆有AMP分子印跡聚合物。

圖1 掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖Fig.1 SEM and TEM images(a)SEM images of Ag;(b)TEM images of Ag;(c)TEM images of Ag@MIPs.

2.2 Ag@MPS和Ag@MIPs的能譜表征

圖2為Ag@MPS、Ag@MIPs的能譜(EDS)圖。圖2a中Ag元素的譜峰來自Ag微粒，Si元素來自于MPS，C元素可能來自于MPS或PVP。圖2b中，Ag元素譜峰來自于Ag微粒，Si元素來自于MPS，N、S元素來自于模板分子AMP?？梢赃M一步證明，Ag微球表面包覆AMP分子印跡聚合物。

圖2 Ag@MPS(a)和Ag@MIPs(b)的能譜(EDS)圖Fig.2 EDS of Ag@MPS(a) and Ag@MIPs(b)

2.3 Ag、Ag@MPS和Ag@MIPs的紅外光譜表征

圖3是Ag、Ag@MPS和Ag@MIPs的紅外(IR)光譜圖?？梢钥闯?，制備的Ag微球表面并無其它雜質；Ag@MPS在870 cm-1、1 088 cm-1處出現較為明顯的吸收峰，它們是Si-O鍵伸縮振動引起；Ag@MIPs在2 990 cm-1處有較為明顯吸收峰，這是AMP中的-CH3伸縮振動引起；1 738 cm-1處的吸收峰，來自AMP中四元環羰基；1 732 cm-1處的吸收峰來自交聯劑酯羰基；1 716 cm-1處的吸收峰可能來自單體或氨芐西林中的羧酸羰基；1 635 cm-1、1 580 cm-1、1 450 cm-1處的吸收峰是由AMP中的苯環骨架振動引起的，1 385 cm-1、1 264 cm-1、1 164 cm-1處的吸收峰由AMP中的C-N的伸縮振動引起。這些特征峰的出現，進一步證明了Ag@MPS 和Ag@MIPs成功制備。

2.4 Ag、Ag@MPS和Ag@MIPs的X射線衍射表征

圖4為Ag微球、Ag@MPS和Ag@MIPs的X射線衍射(XRD)譜圖，其掃描步長為30°～80°。從圖中可知，在2θ=38.175°、44.13°、64.630°、77.606°處出現了明顯的衍射峰，通過對比標準PDF卡片(87-0720)，這些衍射峰分別對應Ag的(111)、(200)、(220)和(311)晶面。對比Ag微球的XRD譜圖可以發現，Ag@MPS 和Ag@MIPs的衍射峰位置并未發生偏移，表明Ag微球表面包覆聚合物后，Ag微球晶型并未發生改變，只是衍射峰強度變弱，其中(111)對應晶面峰的強度降低最大。

圖3 Ag、Ag@MPS和Ag@MIPs的傅立葉紅外(FT-IR)光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of Ag，Ag@MPS and Ag@MIPs

圖4 Ag、Ag@MPS、Ag@MIPs的X射線衍射(XRD)譜圖Fig.4 XRD of Ag,Ag@MPS and Ag@MIPs

圖5 Ag@MIPs基底洗脫不同時間的拉曼譜圖Fig.5 Raman spectra of Ag@MIPs substrate eluted at different times(a) 0 h;(b) 2 h;(c) 12 h;(d) 24 h.

2.5 Ag@MIPs中氨芐西林殘留的考察

圖5中曲線a、b、c、d分別為Ag@MIPs基底洗脫0、2、12、24 h的拉曼光譜圖。可以發現，隨著洗脫時間的推移，Ag@MIPs基底的拉曼峰強度逐漸在降低，洗脫24 h后，幾乎看不到基底的拉曼峰。因此可以斷定，Ag@MIPs基底上的模板分子已經完全洗脫。

2.6 AMP在Ag微球與Ag@MIPs基底上的SERS

圖6中曲線a是AMP標準品的拉曼光譜圖,曲線b、c分別是AMP溶液(1.0×10-3mol/L)在Ag@MIPs和Ag微球基底上的SERS譜圖。對照標準品的拉曼譜圖可以發現Ag微球與Ag@MIPs對AMP的1 040 cm-1(β-內酰胺環振動引起)、1 065 cm-1(苯環C-H鍵彎曲振動引起)、1 151 cm-1(羧基C-O鍵振動引起)等峰位置有明顯增強[17 - 18]。通過對比Ag微球和Ag@MIPs 的SERS的特征峰可以發現，在相同濃度的AMP溶液中，Ag@MIPs的特征峰強度明顯高于Ag微球，這是由于Ag@MIPs對AMP的富集作用使其SERS信號增強。

2.7 Ag@MIPs的SERS檢測限

圖7分別是1.0×10-3～1.0×10-8mol/L的AMP溶液在Ag@MIPs基底上的拉曼譜圖?？梢钥闯觯S著AMP濃度的降低，對應的峰強度逐漸減弱。當AMP溶液的濃度為1.0×10-8mol/L時，吸收峰強度極弱。這是由于隨著AMP溶液濃度的降低，Ag@MIPs吸附的AMP分子減少，激光照到單位面積的AMP分子也隨之逐漸減少，導致拉曼光譜的信號逐漸減弱。當AMP溶液的濃度為1.0×10-8mol/L時，吸收峰強度極弱，由此可以斷定1.0×10-8mol/L為Ag@MIPs基底上拉曼檢測限。

圖6 氨芐西林標準拉曼譜圖(a),氨芐西林(1.0×10-3 mol/L)在Ag@MIPs基底(b)和Ag微球基底(c)的SERSFig.6 Raman spectra of AMP standard (a),SERS of AMP(1.0×10-3 mol/L) on Ag@MIPs substrate(b) and Ag substrate(c)

圖7 不同濃度氨芐西林溶液在Ag@MIPs基底上的SERSFig.7 SERS spectra of different concentration of AMP solution on Ag@MIPs substrate

根據拉曼增強因子(EF)的公式[19]，計算Ag@MIPs基底的EF：本文以1.0×10-3mol/L AMP1 040 cm-1處特征峰強度作為I值，結果為3.79×105。為考察不同濃度AMP與其SERS峰強度的線性相關性，以AMP濃度的對數為橫坐標，不同濃度(1.0×10-3～1.0×10-8mol/L)的AMP在1 040 cm-1處的特征峰強度為縱坐標進行線性擬合，線性回歸方程為：y=850.4x+6 670，相關系數R2=0.959。因此，可以通過檢測AMP的特征峰強度實現其定量檢測。

為了進一步驗證AMP在Ag@MIPs基底上的拉曼光譜重現性，采集濃度為1.0×10-5mol/L的6個樣品的SERS信號。所得結果(圖略)可以看出6個樣品在1 040 cm-1處的拉曼峰強度變化不大，說明AMP在Ag@MIPs基底上的光譜重現性較好。

2.8 Ag@MIPs的競爭吸附研究

圖8中曲線a是AMP標準品的SERS譜圖，曲線b、c是氨芐西林西(1.0×10-3mol/L)、阿莫西林(1.0×10-3mol/L)和苯唑西林(1.0×10-3mol/L)混合溶液分別在Ag@MIPs和Ag微球基底上的SERS譜圖。對比AMP標準品可以看出，在500～2 000 cm-1范圍內，以Ag微球作基底時除了有AMP在1 040、1 065、1 151 cm-1特征峰外，還在1 272、1 418、1 594、1 628 cm-1出現了屬于阿莫西林和苯唑西林的吸收峰；而以Ag@MIPs作基底時AMP的吸收峰較為明顯，阿莫西林和苯唑西林的特征峰很低，幾乎被AMP的特征峰覆蓋。這是因為Ag@MIPs中具有和AMP分子空間結構相匹配的結合位點，可以特異性識別并吸附AMP分子。綜上，Ag@MIPs基底對AMP具有特異吸附性，可在實際樣品的檢測中排除其他雜質分子的干擾。

2.9 不同劑型AMP的SERS檢測

圖9為三種不同劑型的AMP溶液在Ag@MIPs基底上的SERS譜圖。從圖中可以看出，不同劑型的AMP溶液在1 040 cm-1處都有較強的拉曼吸收峰，說明該基底在檢測實際AMP藥品時，可以較好排除其它輔料成分的影響。

圖8 氨芐西林標準品(a)、氨芐西林、阿莫西林和苯唑西林混合溶液在Ag@MIPs基底(b)和在Ag基底上(c)的SERS譜圖Fig.8 SERS spectra of AMP standard(a),AMP and AMX with OXA mixtures on Ag@MIPs(b) and on Ag substrate

圖9 不同劑型的氨芐西林溶液的SERS譜圖Fig.9 SERS spectra of AMP solution with different dosage forms

3 結論

通過分子印跡技術成功制備出核殼型Ag@MIPs，以核殼式Ag@MIPs為基底，將其運用到AMP的SERS檢測。實驗結果表明，該方法制備的核殼式Ag@MIPs具有粒徑均一、分散性好、模板分子易洗脫等特點；利用該基底對AMP檢測有快速、靈敏、光譜重現性好、選擇性強等優點，可用于實際樣品中的AMP的SERS檢測。