配位自組裝的高效電化學界面對色氨酸的手性識別

雷 鵬， 周 影， 洪沙沙， 楊亞娟， 雙少敏

(山西大學化學化工學院，山西太原 030006)

手性是大多數生物分子固有的特性之一，而氨基酸作為組成生命物質的基本單元，不同構型的氨基酸在生物體內發揮著不同作用[1]。例如，人體所需的蛋白質主要是由L-氨基酸參與合成，而D -氨基酸非但不參與人體內蛋白質合成，并可能引起嚴重的副作用[2]。L-色氨酸(L-Trp)是褪黑素和5-羥色胺的蛋白質和前體的必需成分，可改善睡眠、情緒和精神健康[3]，當人體內的L-Trp含量失調，還會引起多種慢性疾病。目前，L-Trp已經被用于安神藥物、食品以及飼料添加劑，而D -Trp屬于非蛋白光學活性的氨基酸，是抗癌和免疫藥物的重要前驅物質。因此，在生命科學和其他相關領域中，構建一種用于識別手性Trp對映異構體的檢測方法至關重要。目前，檢測Trp對映異構體的技術主要包括化學發光法[4]、高效液相色譜法[5]、熒光微量法[6]和電化學方法[7]等。與其他方法相比，電化學方法因具有操作簡單，制備方便，靈敏度高等優點被廣泛應用于氨基酸對映異構體的測定[8 - 9]。

為了提高靈敏度，在傳感器中引進高性能納米材料已經成為研究的熱點，如碳納米管(CNTs)[10]、石墨烯[11]和導電聚合物[12 - 13]。多壁碳納米管(MWCNTs)因其高比表面積，高化學穩定性，優異的導電性而被廣泛地用于電化學研究。此外，MWCNTs和聚合物形成的復合材料不僅對一些生物分子具有優異的電催化能力，而且可以表現出協同作用[14]。

超分子化學的發展為手性化合物的鑒別提供了新的途徑。環糊精是由七個葡萄糖分子組成的環狀多糖，可作為形成超分子結構的理想宿主[15 - 16]，且已廣泛用于從生物環境中選擇性提取手性化合物。由于其親水外表面和疏水內腔，它能夠與尺寸合適的分子形成包合物，因此常被用作識別氨基酸對映異構體。Ou等[17]以石墨烯量子點-β-環糊精(GQD/β-CD)復合材料修飾電極， 利用GQD放大電化學信號及提高識別效率和β-CD的手性微環境，成功識別了Trp對映體。Zaidi[18]將β-CD/還原氧化石墨烯(RGO)復合材料滴凃于電極表面，成功手性識別了苯丙氨酸對映異構體。本文將Cu2+配位在β-CD的寬口處，以Cu2+充當頂蓋，并且迫使Trp異構體通過β-CD的較窄開口進入形成氫鍵，從而達到識別效果。通過循環伏安法將L-精氨酸聚合到MWCNTs表面，進一步將修飾電極浸泡在Cu2+修飾的β-CD中,使其自組裝在電極表面，從而得到Cu-β-CD/PLA/MWCNTs復合膜，并將其修飾在玻碳電極(GCE)表面，以MWCNTs膜作為基底，PLA、Cu-β-CD作為識別元件，構建手性電化學傳感器，從而對Trp對映異構進行手性識別和檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)；UV-2450分光光度計(日本，島津公司)；TensorⅡ紅外光譜儀(德國，Bruker optics公司)。

L-色氨酸(L-Trp，99%)，D -色氨酸(D -Trp，98%)，L-精氨酸(L-Arg，99%),β-環糊精(β-CD)，多壁碳納米管(MWCNTs)和CuSO4·5H2O，均購于阿拉丁試劑公司(中國上海)，其他所用試劑均為分析純。所有溶液都用超純水(18.2 MΩ·cm)制備。

1.2 Cu-β -CD的制備

將15 mL 0.04 mol·L-1的CuSO4溶液加至含0.02 mol·L-1β-CD的10 mL NaOH溶液(0.5 mol·L-1)中，有藍色沉淀Cu(OH)2生成，室溫下持續攪拌12 h，過濾除去沉淀，在濾液中加入200 mL乙醇，形成藍色絮狀物。靜止12 h后將其過濾，用乙醇充分洗滌，在真空干燥箱中于25 ℃下干燥后，備用。

1.3 PLA/MWCNTs/GCE的制備

首先對裸玻碳電極(GCE)用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3依次進行打磨，進一步在無水乙醇和超純水中超聲處理1 min，自然晾干后，取6 μL的MWCNTs(0.6 mg·mL-1)滴涂在GCE表面，紅外燈下烘干，最后用超純水沖洗除去松散吸附的MWCNTs。將MWCNTs/GCE浸泡在含有2.5×10-3mol·L-1L-Arg 的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=6.0)中，采用循環伏安法在-1.6～1.8 V電位范圍以100 mV·s-1掃描10圈，取出用超純水淋洗，室溫晾干得到PLA/MWCNTs/GCE。

1.4 Cu-β -CD/PLA/MWCNTs/GCE的制備

將PLA/MWCNTs/GCE浸泡在含有5.0×10-3mol·L-1Cu-β-CD的0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0)中20 h，得到Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE。

2 結果與討論

2.1 不同電極修飾材料的掃描電鏡(SEM)表征

圖1A、1B和1C分別是MWCNTs、PLA/MWCNTs和Cu-β-CD/PLA/MWCNTs的SEM圖。MWCNTs呈現網狀結構沒有聚集，這種結構可以有效地提高比表面體積并促進電子轉移。L-Arg在MWCNTs表面電聚合后，MWCNTs被包埋在LPA基質中并觀察到多孔簇狀納米復合膜，多孔簇狀結構可能會擴大修飾電極的界面并提供更多的識別位點以擴大識別差異。Cu-β-CD自組裝后形成光滑的褶皺膜結構，同時也表明Cu-β-CD已成功組裝到PLA/MWCNTs表面。

圖1 MWCNTs(A)、PLA/MWCNTs(B)和Cu-β -CD/PLA/MWCNTs(C)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of MWCNTs(A),PLA/MWCNTs(B) and Cu-β -CD/PLA/MWCNTs(C)

2.2 不同修飾電極的電化學表征

采用循環伏安法(CV)研究了在5.0×10-3mol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-溶液(含0.1 mol·L-1KCl)中不同電極界面的電化學行為(掃描速率為100 mV·s-1)。如圖2A所示，在裸GCE上觀察到一對對稱氧化還原峰，用MWCNTs修飾電極后，電流信號明顯增強，證明MWCNTs可以促進電子轉移效率。當L-Arg 引入MWCNTs/GCE表面時，其電流信號略有提高。Cu-β-CD在PLA表面自組裝后，由于Cu-β-CD導電能力弱，使得峰電流減小。

進一步通過電化學交流阻抗譜(EIS)對不同電極界面進行研究。如圖2B所示，與裸GCE相比，MWCNTs/GCE的阻抗顯著降低，表明MWCNTs有良好的導電性并且能促進電子轉移。L-Arg聚合到表面后，半圓幾乎消失，然而Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE顯示出最大的阻抗(800 Ω)，這與CV法的結果一致。

圖2 不同電極在含0.1 mol·L-1 KCl的5.0×10-3 mol·L-1 [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的循環伏安圖(CVs)(A)和交流阻抗圖(EIS)(B)Fig.2 CVs(A) and EIS(B) of different electrodes in 5.0×10-3 mol·L-1 [Fe(CN)6]3-/4- solution containing 0.1 mol·L-1 KCl

2.3 修飾電極對色氨酸異構體的識別

在0.1 mol·L-1PBS(pH = 8.0)中，通過示差脈沖伏安法(DPV)研究1.0×10-3mol·L-1L-Trp和D -Trp 在Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE上的電化學行為(圖3)。在裸GCE上，Trp異構體之間幾乎沒有峰值差異。當引入MWCNTs時，Trp異構體的峰電流明顯增強，然而電位差仍然很小，表明MWCNTs對Trp的氧化具有電催化作用。而PLA/MWCNTs/GCE對Trp的對映選擇性明顯提高，其峰電流比(IL/ID)為2.90，這可能歸因于L-Arg和Trp對映體之間的相互作用。當Cu-β-CD引入時，識別效果進一步提高，峰電流比為3.37，電位差為68 mV。通過Trp在Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE上的識別效果，可知識別能力是P-L-Arg和Cu-β-CD的協同作用，增加了手性識別的差異，從而提高了識別效率。

圖3 1.0×10-3 mol·L-1的L-Trp(a)和D -Trp(b)的在不同電極上的示差脈沖伏安(DPV)響應Fig.3 DPV responses of 1.0×10-3 mol·L-1 L-Trp(a) and D -Trp(b) at different electrodes(A) bare GCE;(B) MWCNTs/GCE;(C) PLA/MWCNTs/GCE;(D) Cu-β -CD/PLA/MWCNTs/GCE.

2.4 Trp對映異構體的電化學檢測

為了進一步研究不同濃度Trp對映異構體在Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE上的電流響應，采用DPV法對一系列濃度的Trp對映異構體進行檢測，結果見圖4。結果表明隨著Trp濃度增大，電流響應信號也隨之增大，并且與Trp濃度呈線性關系。在1.0×10-6～5.5×10-5mol·L-1范圍內呈現良好的線性相關，檢出限(S/N=3)可達3.3×10-7mol·L-1。二者的線性方程分別為：Ip(μA)=2.079+0.293cL-Trp(R2=0.9945)；Ip(μA)=2.143+0.104cD -Trp(R2=0.9932)。

圖4 不同濃度L-Trp(A)和D -Trp(B)對映異構體在Cu-β -CD/PLA/MWCNTs/GCE上的DPV響應(內插圖為相應校正曲線)Fig.4 DPV responses of different concentrations for L-trp(A) and D -Trp(B) at Cu-β -CD/PLA/MWCNTs/GCE(Inset shows the corresponding calibration plots)

2.5 Trp對映異構體檢測比較

目前，采用電化學方法對Trp對映異構體識別和檢測已取得了很大的進展。在表1中，將本方法與現有的研究成果進行比較，結果證明Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE對Trp對映異構體展現出較高的手性識別、較低的檢測限和較寬的線性范圍。

表1 色氨酸對映異構體識別方法對比

3 結論

本文將Cu-β-CD自組裝在PLA/MWCNTs納米復合膜上，然后修飾在玻碳電極表面，構建了一個電化學手性傳感器Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE，并將其用于L-Trp和D -Trp的手性識別研究。由于L-Trp 和D -Trp的空間構型的差異，導致異構體與Cu-β-CD產生不同程度的包合作用，從而達到手性識別效果。實驗結果表明，該傳感器可以對Trp手性異構體進行有效地識別檢測，有望應用于實際檢測中。