單極紡錘體蛋白激酶1對骨肉瘤細胞植入裸鼠腫瘤生長的影響▲

卓航宇 賀玉棚 陸 潞 楊 埜 陳金忠 謝克恭 劉 佳 黃 可 唐毓金

(1 右江民族醫學院研究生學院，廣西百色市 533000，電子郵箱：lcyxdc@163.com；2 右江民族醫學院附屬醫院脊柱骨病外科，廣西百色市 533000)

骨肉瘤在各年齡段均可發病，但原發性高度惡性骨肉瘤主要見于10～20歲的人群。高度惡性骨肉瘤發生于髓腔，可以穿破骨皮質并形成軟組織腫塊，惡性程度高，易復發及轉移[1]，給患者的生理、心理造成嚴重打擊，并給家庭帶來了巨大的經濟負擔。大劑量非靶向的化療藥物具有較大的毒副作用，以及原發性、繼發性的耐藥性，而新輔助化療手段具有一定的局限性，因此這些抗腫瘤手段的治療效果不理想[2-3]。隨著分子生物學的發展，有學者發現基因的突變性介導骨肉瘤的發生、發展及轉移過程[4]。

細胞周期中，細胞有絲分裂的過程可分為前期、前中期、中期、后期和末期。細胞有絲分裂的前中期有紡錘體組裝檢查點(spindle assembly checkpoint，SAC)，其對細胞的有絲分裂起重要的調控作用，當紡錘體未能正確捕捉染色體并將其排列到有絲分裂中期板上時，被激活的SAC將會阻滯有絲分裂中期到后期的啟動過程，從而防止細胞錯誤的分裂及非整倍體的產生[5]。非整倍體對腫瘤細胞的產生具有促進作用，因此SAC可維持細胞遺傳信息的穩定性[6]。

單極紡錘體蛋白激酶1(monopolar spindle kinase 1，Mps1)是一個具有雙重特異性的蛋白質激酶，可以磷酸化酪氨酸或者絲氨酸/蘇氨酸殘基[7]。Mps1的主要功能是激活有絲分裂期的SAC和完成中心體的復制，從而有效地阻止有絲分裂期間染色體的錯誤分離和非整倍性的錯誤附著[8]。有學者發現，Mps1的功能異常可導致正常的細胞周期失去控制，從而導致各種疾病的發生，而在人類的某些腫瘤疾病中，Mps1的過表達與疾病的不良預后相關[9]，通過抑制Mps1的活性，使未附著的染色體在早期退出有絲分裂，致使細胞的染色體錯誤分離為非整倍體，誘導腫瘤細胞死亡，減少腫瘤的發生[10-11]，可能是治療腫瘤的一個新方向。本研究探討干預Mps1蛋白的表達對裸鼠骨肉瘤發生發展的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞、動物及主要試劑

1.1.1 細胞株：人骨肉瘤細胞株143B，購自美國ScienCell研究實驗室。

1.1.2 實驗動物：無特定病原體級健康Balb/c雌性裸鼠20只，鼠齡4～6周，體質量15～18 g，購自湖南長沙天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXK(湘)2014-0011，喂養于嚴格消毒的無菌層流動物房內，環境溫度25℃，空氣濕度為60%～70%，飼料和水經嚴格消毒后自由進食。實驗過程中對動物的處置符合2009年《動物實驗倫理問題》相關動物倫理學標準的條例并經右江民族醫學院動物倫理委員會論證。

1.1.3 主要試劑和儀器：Mps1過表達慢病毒載體pLenti-MPS1-IRES-EGFP及陰性對照病毒液pLenti6.3-NC-EGFP購自Invitrogen公司(批號：RS20141225)；杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)購自Gibco公司(批號：10099-141)，胎牛血清購自Gibco公司(批號：1966173C)，胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(0.25%)含酚紅消化液購自Solarbio公司(批號：T1320)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)購自Solarbio公司(批號：P1020-500)；兔抗鼠一抗(抗Mps1)購自Abcam公司(批號：ab197382)；羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物科技有限公司(批號：ZB-2305)；Mps1抑制劑Mps1-IN-3購自MCE公司(批號：HY-12401)。超凈工作臺、恒溫CO2培養箱購自美國Thermo Scientific公司；5424R型低溫高速離心機、微量移液槍購自德國Eppendorf公司；IX73倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒轉染143B骨肉瘤細胞及篩選穩定轉染細胞株：用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養143B骨肉瘤細胞，置于37℃、5% CO2的飽和濕度細胞培養箱。取生長狀態良好的對數生長期143B細胞，以3×103個細胞/100 μL接種于96孔板中，于37℃、5% CO2培養箱中培養過夜，待細胞長滿至40%～60%時，加入6 mL pLenti-MPS1-IRES-EGFP病毒液轉染143B細胞(Mps1過表達組)，同時用陰性對照病毒液pLenti6.3-NC-EGFP轉染143B細胞作為空病毒載體組，未轉染的細胞作為空白對照組。轉染72 h后，在白光視野及熒光顯微鏡下觀察各組細胞綠色熒光蛋白的表達情況。取轉染后的143B細胞以3×103個細胞/100 μL接種于96孔板中，細胞鋪板24 h后，根據前期實驗，加入最佳篩選濃度(0.5 μg/mL)的殺稻瘟菌素，每3 d更換新的含殺稻瘟菌素的完全培養液，連續培養14 d，收集抗性細胞，即為穩定轉染Mps1過表達的細胞株。

1.2.2 細胞收集：收集3組穩定轉染的對數生長期143B細胞，經胰蛋白酶消化及PBS洗滌后，置于離心機4℃、800 r/min離心3 min，離心2次，棄上清，進行活細胞計數后用無血清的DMEM培養液重懸，制成1×107個/L的細胞懸液，分別裝在EP管中，4℃低溫保存備用。

1.2.3 裸鼠分組及建立骨肉瘤模型：采用隨機數字表法將20只裸鼠分為Mps1過表達組、空病毒載體組、對照組、Mps1抑制組，每組5只。Mps1過表達組注射Mps1過表達143B細胞；空病毒載體組注射空病毒載體轉染的143B細胞；對照組和Mps1抑制組注射正常的143B細胞。注射方法：碘酊消毒裸鼠右側前肢背部皮膚，再用75%乙醇拭去碘酊，用DMEM培養液重懸步驟1.2.2中獲得的細胞懸液，用1 mL注射器吸取0.2 mL細胞懸液(約含1×107個細胞)，注射于裸鼠右前肢背部，以穿透裸鼠整個皮層但不進入肌層為宜，完成注射后用無菌鑷子輕夾1 min，防止細胞懸液從針口處流出。注射7 d后，Mps1抑制組裸鼠腹腔注射2 mg/kg的Mps1抑制劑(由Mps1-IN-3溶于生理鹽水制成)，0.4 mL/次，Mps1過表達組、空病毒載體組、對照組注射等量的生理鹽水，均為2次/周，連續注射5周。

1.3 觀察指標 (1)裸鼠體重、腫瘤體積及重量：待裸鼠成瘤后每周用游標卡尺測量腫瘤的長徑(a) 、短徑(b)， 按Carlsson公式[12]計算腫瘤的體積，體積=1/2a×b2。每周記錄裸鼠體重。給予Mps1抑制劑5周后，處死各組裸鼠，稱量腫瘤的重量。(2)Mps1表達水平：處死裸鼠后，將瘤體組織取出，固定、石蠟包埋后切片，厚度為5 μm，置于附有多聚賴氨酸的載玻片上。常規脫蠟水化后，對組織抗原進行修復。PBS洗滌3次，5次/min，5%牛血清蛋白室溫封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次，5次/min，滴加相應二抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，5次/min，經PBS洗滌后用辣根過氧化物酶顯色、復染、脫水、封固。光學顯微鏡下觀察并拍照，在各組切片的監測區域隨機選擇3個視野，對Mps1蛋白表達陽性的細胞進行計數，然后計算陽性細胞占視野范圍內細胞總數的百分比。(3)蘇木精-伊紅染色：將各組裸鼠瘤體固定后，石蠟包埋，切片，切片厚度為5 μm，烤片脫蠟后，行蘇木精-伊紅染色，脫水透明后予以封固。光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 Mps1慢病毒轉染143B細胞的效果 Mps1過表達組和空病毒載體組表達綠色熒光蛋白的細胞數多于空白對照組，且Mps1過表達組和空病毒載體組轉染效率達90%，說明轉染成功，可用于裸鼠成瘤實驗。見圖1。

Mps1過表達組(白光) Mps1過表達組(熒光) 空病毒載體組(白光)

空病毒載體組(熒光) 空白對照組(白光) 空白對照組(熒光)

圖1 Mps1慢病毒轉染143B細胞的效果(×10)

2.2 植入143B細胞后裸鼠生長情況 植入143B細胞系后2～4 d，各組裸鼠接種部位的液包消失，1周左右裸鼠右前肢背部可見皮下小包塊，質硬，活動度一般，見圖2。隨著時間推移各組裸鼠的體重存在差異，見圖3。在實驗的后期，Mps1過表達組、空病毒載體組和對照組的裸鼠均出現不同程度的惡病質狀態，Mps1過表達組最為嚴重，瘤體可見壞死結痂。

2.3 4組裸鼠腫瘤情況比較 給藥第5周時，Mps1過表達組腫瘤體積、重量均大于其他各組，Mps1抑制組腫瘤體積最小，重量最輕(均P<0.05)，見表1。給藥期早期，Mps1過表達組裸鼠腫瘤體積增長較快，給藥后期，其腫瘤體積增長較緩慢；給藥期間Mps1抑制組裸鼠腫瘤體積增長緩慢，見圖4。解剖瘤體可見瘤體呈灰白魚肉樣，Mps1過表達組的瘤體個體較大，可見部分液化壞死，見圖5。

A：植入143B細胞1周后的裸鼠 B：植入143B細胞5周后的裸鼠

圖2 對照組植入143B細胞后裸鼠形態

圖3 各組裸鼠體重變化曲線

組別n腫瘤體積(mm3)腫瘤重量(g)對照組51678.0±104.1?#2.1±0.3?#Mps1過表達組52366.0±299.23.2±0.2空病毒載體組51558.0±146.9?#2.4±0.3?#Mps1抑制組5350.8±63.6?1.0±0.3? F值111.41534.456P值<0.001<0.001

注：與Mps1過表達組比較，*P<0.05；與Mps1抑制組比較，#P<0.05。

圖4 4組裸鼠腫瘤體積變化曲線

圖5 第5周時 4組裸鼠瘤體外觀

2.4 4組裸鼠腫瘤組織Mps1表達水平比較 Mps1過表達組瘤體組織的Mps1蛋白表達水平高于其他3組，Mps1抑制組瘤體組織的Mps1蛋白表達水平低于其他3組(均P<0.05)，對照組與空病毒載體組Mps1蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6～7。

對照組 Mps1過表達組 空病毒載體組 Mps1抑制組

圖6 4組裸鼠瘤體組織Mps1蛋白表達情況(×40)

圖7 4組裸鼠瘤體組織Mps1蛋白表達水平比較

2.5 4組裸鼠腫瘤組織蘇木精-伊紅染色結果 蘇木精-伊紅染色結果顯示，4組裸鼠骨肉瘤組織細胞核大，深染，其中143B細胞形態未見明顯差異。見圖8。

對照組 Mps1過表達組 空病毒載體組 Mps1抑制組

圖8 4組裸鼠腫瘤組織蘇木精-伊紅染色結果(×40)

3 討 論

雖然醫療水平不斷進步，但近40年來，骨肉瘤患者的長期生存率一直維持在60%～75%[13]。尋找安全有效的靶向性藥物對于延長骨肉瘤患者長期生存率具有重要意義。研究表明，Mps1是SAC的必需基因，位于SAC調控通路的上游，對SAC功能的激活和維持有重要作用，是細胞有絲分裂中后期染色體正確排列與分離的關鍵因子[14-15]。

有研究顯示，在乳腺癌、肺癌、胃癌、結腸癌等多種腫瘤組織中Mps1處于高表達水平，Mps1的過表達促進了非整倍體腫瘤的發生發展，且對非整倍體腫瘤細胞具有保護作用[16]。有學者發現，在結腸癌細胞系中，Mps1的過表達可減弱SAC功能，從而促使結腸癌細胞的增殖，而抑制結腸癌細胞系Mps1的表達則可抑制腫瘤細胞的生長[17]。本研究結果顯示，Mps1過表達組的裸鼠腫瘤體積以及重量均高于其他3組，而Mps1抑制組裸鼠腫瘤體積及重量均低于其他3組(均P<0.05)，這與上述研究結果相似。本研究結果顯示，Mps1過表達組裸鼠腫瘤的生長快于其他3組，但在后期，Mps1過表達組裸鼠腫瘤生長速度減緩，且裸鼠出現惡病質狀態，剝離解剖瘤體后發現，瘤體的中間部分液化壞死，考慮可能是裸鼠出現惡病質，進而導致自身營養生存狀態無法滿足瘤體的生長需求，因此瘤體的生長速度減緩且部分壞死。對照組和空載體組腫瘤體積也呈增長趨勢，可能與骨肉瘤細胞143B中Mps1表達水平比較高，已經達到適合腫瘤發生發展的水平有關。

近年來，Mps1-IN-1、 Mps1-IN-2等一系列抑制Mps1激酶活性的小分子化合物的研制，為靶向抗腫瘤治療提供了新思路[18-19]。有學者發現，小型分子Mps1抑制劑能有效抑制乳腺癌細胞系的增殖以及乳腺癌模型裸鼠腫瘤的生長[20]。本研究中，Mps1過表達組瘤體組織Mps1蛋白表達水平升高，而Mps1抑制組采用Mps1-IN-3抑制Mps1的表達后，瘤體組織Mps1蛋白表達水平降低(均P<0.05)，骨肉瘤瘤體的生長受到抑制，但是瘤體仍然有微弱的生長趨勢，提示瘤體的生長未能被完全抑制，考慮與本研究的給藥途徑有關。此外，Mps1抑制劑的藥物吸收率是否達到完全抑制骨肉瘤生長的要求還不能完全確定；單用Mps1抑制劑對抑制腫瘤生長的效果可能還不理想，如若聯合紫杉醇、順鉑等其他抗腫瘤藥物是否會獲得更好效果，仍需進一步研究。

綜上所述，上調Mps1蛋白的表達水平可促進骨肉瘤的發展，而抑制Mps1激酶的活性可抑制骨肉瘤的生長。Mps1或可成為抗腫瘤治療的新靶點，但Mps1對SAC信號通路的調控作用機制仍需進一步研究。