吡柔比星聯合羥喜樹堿灌注化療對晚期膀胱癌細胞惡性生物學行為的影響

吳建軍 羅 源 董 磊

(湖北省武漢市紅十字會醫院1 泌尿外科，2 腫瘤科，武漢市 430050，電子郵箱：zengjg2@163.com)

膀胱癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤，男性發病率較高，以無痛性肉眼血尿為主要臨床表現，部分患者臨床表現不明顯，診斷時已為晚期[1-2]。晚期膀胱癌的治療以局部腫瘤切除為主，術后輔以膀胱灌注化療防止復發，但不同灌注化療方案可帶來不同治療結局[3]。羥喜樹堿、吡柔比星是目前臨床應用最多的膀胱癌灌注化療藥物。本研究比較吡柔比星單獨灌注化療與吡柔比星聯合羥喜樹堿灌注化療對晚期膀胱癌細胞惡性生物學行為的影響，為臨床治療提供參考，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2014年1月至2017年11月在本院治療的77例晚期膀胱癌患者臨床資料，患者均采用膀胱灌注化療。納入標準：(1)符合原發性膀胱癌診斷標準[4]，腫瘤分期為晚期；(2)均為首次確診；(3)可耐受化療毒副作用；(4)預計生存時間≥3月；(5)患者及家屬簽署知情同意書。排除標準：(1)合并其他組織臟器原發性惡性腫瘤者；(2)合并全身感染性疾病者；(3)出現化療藥物嚴重毒副反應并導致治療中斷者；(4)治療期間死亡、數據缺失者。根據膀胱灌注化療方案將患者分為吡柔比星組40例與聯合治療組37例，其中吡柔比星組男23例、女17例，年齡48～79(58.72±8.82)歲，病程(1.94±0.32)年，手術時間(92.93±11.84)min；聯合治療組中男20例、女17例，年齡45～78(59.23±8.23)歲，病程(2.08±0.36)年，手術時間(95.12±12.18)min。兩組患者一般資料比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。

1.2 治療方法 兩組患者均采用膀胱部分切除術治療，術后開始規律膀胱灌注化療。吡柔比星組采用吡柔比星膀胱灌注化療：吡柔比星(海正輝瑞制藥有限公司，國藥準字H20045983)30 mg+5%葡萄糖注射液40 mL，膀胱灌注30 min后方可排尿。1次/周，連續灌注化療8周后改為每月1次，再繼續治療10次，共18次。聯合治療組采用吡柔比星聯合羥喜樹堿膀胱灌注化療：吡柔比星30 mg+羥喜樹堿(貴州漢方制藥有限公司，國藥準字H20033960)20 mg+5%葡萄糖注射液40 mL，膀胱灌注30 min后方可排尿。1次/周，連續灌注化療8周后改為每月1次，再繼續治療10次，共18次。

1.3 膀胱癌細胞惡性生物學行為相關基因表達量檢測 兩組患者完成所有膀胱灌注化療后，行膀胱鏡檢查并在膀胱鏡下剪取約1 mm3的病變組織標本，生理鹽水沖洗后在液氮內短暫冷凍，取出后在-80℃冰箱保存。采用熒光定量PCR法檢測膀胱癌細胞相關增殖基因、侵襲基因及凋亡基因mRNA的相對表達水平。增殖基因包括三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白E亞族成員1(adenosine triphosphate-binding cassette sub-family E member 1，ABCE1)、核轉運蛋白α2(karyopherin alpha 2，KPNA2)、線粒體核糖體蛋白S5(mitochondrial ribosomal protein S5，MRPS5)、yes相關蛋白(yes-associated protein，YAP)、DKK2、人源性長壽保障基因2(homo sapiens longevity assurance homologue 2，LASS2)。侵襲基因包括整合素相關激酶(integrin-linked kinase，ILK)、核因子-κBp65(nuclear factor-κBp65，NF-κBp65)、高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)。凋亡基因包括 Livin、Bad、Survivin、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3)、BAG-1。PCR試劑盒均購自北京康為世紀公司(批號：CW2601S)，PCR反應后自動生成循環曲線和循環閾值(Ct)，根據公式2-△△Ct計算基因mRNA表達量。

1.4 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。計量資料用(x±s)表示，比較采用t檢驗。P<0.05為差異統計學有意義。

2 結 果

2.1 兩組患者膀胱癌細胞增殖基因相對表達量比較 聯合治療組ABCE1、KPNA2、MRPS5、YAP的mRNA相對表達量均低于吡柔比星組，DKK2、LASS2的mRNA相對表達量均高于吡柔比星組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者膀胱癌細胞增殖基因相對表達量比較(x±s)

2.2 兩組患者膀胱癌細胞侵襲基因相對表達量比較 聯合治療組ILK、NF-κBp65、HMGB1的mRNA相對表達量均低于吡柔比星組，PPARγ的mRNA相對表達量高于吡柔比星組(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者膀胱癌細胞侵襲基因相對表達量比較(x±s)

2.3 兩組患者膀胱癌細胞凋亡基因相對表達量比較 聯合治療組Livin、Survivin、BAG-1 的mRNA相對表達量均低于吡柔比星組，Bad、Caspase-3的mRNA相對表達量均高于吡柔比星組(均P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者膀胱癌細胞凋亡基因相對表達量比較(x±s)

3 討 論

晚期膀胱癌的治療以局部腫瘤切除聯合膀胱灌注化療為主，化療方案的選擇可能直接影響患者預后[5]。羥喜樹堿及吡柔比星具有降低腫瘤細胞惡性活力的作用，應用于不同惡性腫瘤的治療中可獲得較好的療效。有學者推薦將吡柔比星與羥喜樹堿聯合用于晚期膀胱癌患者的膀胱灌注化療中，以提高療效[6-7]。

晚期癌癥患者的癌細胞增殖旺盛，是腫瘤體積不斷擴大及機體腫瘤負荷持續增加的基礎，多種增殖相關基因參與其中。ABCE1是參與腫瘤形成及發展的新型調控分子，可阻斷抗病毒2-5A/RNase L通路，抑制細胞凋亡并促進其增殖，在多種惡性腫瘤組織中均呈高表達[8-9]。KPNA2是一種相對保守的核轉運蛋白，可調節細胞核內多條信號通路的下游分子表達，目前已經在乳腺癌、卵巢癌、食管癌等惡性腫瘤組織中發現其異常高表達，細胞學研究發現沉默KPNA2表達可顯著抑制膀胱癌細胞的增殖能力[10-11]。MRPS5可通過線粒體代謝機能障礙途徑調控小鼠壽命，與機體衰老、腫瘤發生易感性均相關[12]。YAP屬于Hippo信號通路下游轉錄因子，通過磷酸化修飾作用在多種腫瘤的發生發展中發揮重要作用，目前已經證實其在膀胱尿路上皮癌中表達異常上調，且具體表達量與腫瘤分期、預后密切相關[13-14]。DKK2是調控Wnt信號通路的常見分泌型蛋白，其在結腸癌、腎癌、胃癌等多種惡性腫瘤中呈高度甲基化，扮演抑癌基因的作用[15]。LASS2可抑制多種腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移，其低表達甚至不表達是惡性腫瘤進展的主要原因[16]。本研究結果顯示，聯合治療組ABCE1、KPNA2、MRPS5、YAP mRNA相對表達量均低于吡柔比星組，DKK2、LASS2 mRNA相對表達量均高于吡柔比星組(均P<0.05)，說明吡柔比星聯合羥喜樹堿灌注化療更能抑制膀胱癌細胞的增殖能力。

惡性腫瘤細胞的侵襲轉移有賴于一系列侵襲相關基因的異常表達，檢測其具體表達量也可定量反映癌細胞的侵襲活力。ILK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞與細胞外基質黏附的關鍵成分，可與整合素β1的亞單位結合并影響多條信號通路的蛋白表達[17]。ILK過表達可經多種途徑抑制癌細胞凋亡并促進其增殖、侵襲。NF-κBp65是重要的核轉錄因子，在許多惡性腫瘤細胞中存在持續激活的NF-κBp65，故特異性抑制其表達也成為治療惡性腫瘤的新途徑[18]。HMGB1是細胞核內的重要結構蛋白，具有協助基因轉錄、穩定細胞核等作用，同時可促進DNA損傷修復。有學者指出，在肝癌、前列腺癌、胃腸道惡性腫瘤中均存在HMGB1的特異性過表達，且具體表達量與癌細胞的侵襲能力呈正相關[19-20]。PPARγ是一種細胞內轉錄因子，其激動劑具有明顯抗腫瘤作用，惡性腫瘤組織中其異常低表達[21]。本研究結果顯示，聯合治療組ILK、NF-κBp65、HMGB1 mRNA相對表達量均低于吡柔比星組，PPARγ mRNA相對表達量高于吡柔比星組(均P<0.05)，說明吡柔比星聯合羥喜樹堿灌注化療更能抑制膀胱癌細胞的侵襲能力。

凋亡是一種程序化死亡過程，老化或者損傷細胞的凋亡是維持機體正常新陳代謝過程的重要環節，損傷細胞的凋亡受阻是細胞惡變的起始環節，其本質是促凋亡基因/抗凋亡基因的表達失衡。Livin屬于凋亡蛋白抑制因子家族，在多種惡性腫瘤中呈高表達并阻礙癌細胞的正常凋亡、促使其增殖遷移[22]。Bad是一種促凋亡基因，研究證實其在肝內膽管癌中表達缺失，且在多種其他惡性腫瘤中呈異常低表達[23]。Survivin屬于抗凋亡基因，生理狀態下在成人正常組織中表達量較低，但在腫瘤惡變后可大量表達于腫瘤組織中，參與癌細胞的持續增殖及凋亡抑制[24]。Caspase-3是幾乎所有細胞凋亡執行的重要分子，受多種基因調控，其異常低表達是細胞凋亡受阻的直接原因[25]。BAG-1具有增強細胞抗凋亡能力的作用，細胞學研究發現高表達的BAG-1細胞株可有效阻止細胞毒性T細胞誘導的細胞凋亡[26]。本研究結果顯示，聯合治療組Livin、Survivin、BAG-1 mRNA相對表達量均低于吡柔比星組，Bad、Caspase-3 mRNA相對表達量均高于吡柔比星組(均P<0.05)，說明吡柔比星聯合羥喜樹堿灌注化療更能促進癌細胞的凋亡進程。

綜上所述，相比于單用吡柔比星膀胱灌注化療，采用吡柔比星聯合羥喜樹堿膀胱灌注法治療晚期膀胱癌患者能更有效抑制地癌細胞的增殖、侵襲活力，并促進癌細胞凋亡，值得推廣應用。