新生兒攜帶IMP-4肺炎克雷伯菌的分子分型特征▲

梁軍榮 潘新年 黃維真 梁志坤 張 清 閆 芳 潘慧敏

(廣西壯族自治區婦幼保健院外科，南寧市 530021，電子郵箱：1742644494@qq.com)

肺炎克雷伯菌是新生兒感染最常見的病原菌之一，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的出現給新生兒感染的治療、院內感染的控制帶來很大的困難。研究耐藥菌的分子分型對臨床診斷、控制醫院感染的暴發流行具有重要意義。多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)技術是直接檢測多個管家基因的核苷酸序列從而發現細菌變異的分型方法，多用于種群結構和進化關系的研究。因此，本研究采用MLST技術對攜帶IMP-4基因的肺炎克雷伯菌進行序列分型研究，并采用eBURST軟件進行親緣分析，旨在為醫院感染控制提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集2013年6月至2017年6月在廣西壯族自治區婦幼保健院(新陽和廂竹院區)、南寧市婦幼保健院住院的新生兒血、痰、肺泡灌洗液、分泌物等樣本，分離獲得的49株耐亞胺培南、美羅培南或厄他培南肺炎克雷伯菌。其中，應用法國生物梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀進行細菌鑒定及藥敏試驗[最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)法]，根據美國臨床和實驗室標準協會(2016)的標準，厄他培南MIC≥2 μg/mL，或者美羅培南、亞胺培南MIC≥4 μg/mL的肺炎克雷伯菌為耐藥菌株，所需標準菌株(大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603)均由廣西臨床檢驗中心提供。剔除同一患兒相同部位的重復菌株。

1.2 攜帶IMP-4肺炎克雷伯菌的篩選及鑒定 提取49株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌DNA(煮沸法)、PCR擴增碳青霉烯酶基因、序列測定(由Inviotrigen公司完成)，經與GenBank序列比對，其中10株檢出IMP基因，均為blaIMP4型；與NCBI Blast數據庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的數據進行對比，發現其與IMP-4亞型同源性達99%。

1.3 主要試劑及儀器 PCR DNA聚合酶購于天根生物公司(批號：S7116)，胰蛋白胨(批號：2324507)和酵母提取物(批號：2340951-02)購自Oxid公司。Gel DocTMXR電泳凝膠圖像分析系統(美國的Bio-Rad公司)，TOne 96G梯度PCR儀(美國Biometra公司)。

1.4 引物合成 參照MLST網站(http://spneumoniae.mlst.net/)提供的引物序列,由Inviotrigen公司合成gapA、infB、 mdh、pgi、phoE、rpoE、tonB 7個管家基因引物。

1.5 管家基因的PCR檢測 25 μL反應體系：PCR DNA聚合酶12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，細菌總DNA 3 μL，雙蒸水8.5 μL。反應步驟：95℃ 5 min；95℃ 40 s；50℃ 40 s；72℃ 1 min，共35個循環；72℃ 10 min。反應結束后4℃電泳鑒定。

1.6 電泳及PCR產物回收 取PCR產物加樣于溴化乙錠凝膠上，120 V電泳30 min，在凝膠成像系統下觀察并拍照，然后切膠送Inviotrigen公司測序。

1.7 序列比對和MLST數據分析 將序列提交到數據庫(http://bigsdb.web.pasteur.fr/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef_public)進行在線序列比對，獲得管家基因等位基因編碼，與gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB成為管家基因譜組合，每個編碼組合對應 1 個序列型，與MLST數據庫中已有管家基因譜進行比對，得到每株細菌序列型。

1.8 PCR檢測β-內酰胺酶耐藥基因 參考GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)基因序列信息并合成β-內酰胺酶耐藥基因擴增引物，引物由Inviotrigen公司合成。PCR的反應體系和反應步驟參照管家基因的PCR 擴增、測序。

1.9 eBURST分析 采用eBURST軟件version 3(http://eburst.mlst.net/)對本研究獲得的等位基因序列進行親緣分析。7個位點中有≥6個相同歸類為1個分型組,1個分型組中包含≥3個序列型的定義為1個克隆復合體(clonal complex,CC)。每個CC中有1個經計算推測出的起源序列型,被認為是祖先序列型,復合體中的其他序列型通過直線與起源序列型相連,直線長度表示親緣關系遠近。

2 結 果

2.1 MLST結果 經與MLST數據庫進行比對，10株攜帶IMP-4的肺炎克雷伯菌可分成6個序列型，其中以序列型20為主(4株)，占40%,分布在兩家醫院，其次為序列型1473，占20%。所有菌株均檢測到耐藥基因SHV-11及TEM-1。見表1。

表1 10株攜帶IMP-4的肺炎克雷伯菌的序列型及耐藥基因

注：A為廣西區婦幼保健院(廂竹院區)，B為廣西區婦幼保健院(新陽院區)，C為南寧市婦幼保健院。

2.2 eBURST分析結果 10株菌株有1個主要CC(CC11)，包含序列型20、序列型37、序列型234，涉及6株菌株(占60%)，屬于祖先型為序列型11的復合體，其他均可認為是單獨的序列型，而不屬于任何一個CC，見表2。

表2 10株攜帶IMP-4的肺炎克雷伯菌的eBURST分析結果

注：FREQ為菌株出現頻率，SLV 為單位點突變， DLV為雙位點突變，TLV為三位點突變，SAT為衛星型。

3 討 論

近年來，在新生兒中出現耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，但有關新生兒耐藥基因的研究報道較少。本研究在新生兒中收集到的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌主要是產B類碳青霉烯酶，IMP-4是其主要基因型[1-2]。其編碼基因同時攜帶β-內酰胺酶耐藥基因SHV-11、TEM-1，由于常與其他耐藥基因共存，可引起對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、單酰胺類等抗生素的多重耐藥。

MLST分析結果顯示，10株攜帶IMP-4的肺炎克雷伯菌分為6個不同序列型，其中以序列型20為主，其次是序列型1473；同一基因型可存在于不同的醫院，同一醫院存在不同基因型，即序列型別分布散在，型別未呈現集中的趨勢，提示上述菌株的遺傳背景具有多樣性。

目前，國內外有關攜帶IMP-4的肺炎克雷伯菌的MLST分析研究極少，所報告的序列型別也有所不同，在澳大利亞其型別為序列型1727、序列型1728、序列型1729[3]，在中國香港為序列型1306、序列型889[4]，在中國大陸有序列型105、序列型1876、序列型147[5-6],未見有關主要型別及流行型別的研究報道。目前，國內未見攜帶IMP-4型的序列型20肺炎克雷伯菌的研究報道，但有報道顯示，在山東省一家新生兒病房序列型20見于NDM-1型的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌[7]，而在希臘其見于攜帶SHV-5型的肺炎克雷伯菌[8]，兩者的共同特點是序列型20肺炎克雷伯菌可引起新生兒感染的暴發。本研究納入兩家醫院的新生兒中， 序列型20是攜帶IMP-4的肺炎克雷伯菌最主要的克隆株，據此推測序列型20易捕獲攜帶B類碳青霉烯酶基因的耐藥質粒,引起新生兒感染。同時，eBURST分析結果顯示，序列型20、序列型37、序列型234同屬一個主要CC，序列型11為其祖先型。序列型11是我國攜帶kpc-2的肺炎克雷伯菌的主要克隆型[9]，序列型20與序列型11有較近的親緣關系，Institut Pasteur MLST 數據庫(http://bigsdb.web.pasteur.fr/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef_public)顯示序列型11與序列型20之間只存在3個管家基因(rpoB、phoE、infB)的差異。

此外，本研究中，4株序列型20分別來自兩家醫院，分離時間集中在2013年，其中1株分離時間是2013年12月，其余3株來自同一家醫院，分離時間在2013年7月，表明攜帶IMP-4的肺炎克雷伯菌在本地區同一家醫院具有較高聚集性，可能存在序列型20肺炎克雷伯菌院內感染的發生；且4株序列型20均攜帶IMP-4、SHV-11、TEM-1基因，具有相同的基因特征。這提示攜帶IMP-4 的序列型20肺炎克雷伯菌感染在本地區同一家醫院曾出現暴發。

總之，序列型20是這兩家醫院新生兒產IMP-4肺炎克雷伯菌的主要流行克隆群，且序列型20在其中一家醫院中曾發生醫院感染暴發，應引起醫院相關部門和醫務人員的高度重視。