廣西扶綏縣壯族人群MASP1基因單核苷酸多態性與肝癌遺傳易感性的關系▲

郭 輝 魏斐斐 蔣群湘 謝裕安

(1 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院實驗研究部，南寧市 530021，電子郵箱：guohui6222@163.com；2 廣西桂林市人民醫院放療科，桂林市 541002；3 廣西柳州市人民醫院放療科，柳州市 545006)

在我國，原發性肝細胞癌(下稱“肝癌”)的發病率和死亡率分別高居惡性腫瘤的第四位和第二位[1]，極大威脅著居民的生命健康。廣西扶綏縣是我國肝癌高發地區之一，具有明顯的家族聚集性[2]。肝癌的發生發展在很大程度上與個體間基因型的遺傳多態性密切相關。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)作為第三代遺傳標記，有助于解釋不同群體或個體對腫瘤易感性的差異[3]。甘露聚糖結合凝集素關聯絲氨酸蛋白酶(mannan-binding lectin-associated serine protease,MASP)1基因位于染色體3q27-3q28，含有18個外顯子，其可通過前mRNA剪切編碼3種蛋白質，即MASP1、MASP3、甘露聚糖結合凝集素相關蛋白44(mannan-binding lectin-associated protein 44,MAp44)[4]。其中，MASP1是補體激活途徑的重要組成部分，可影響機體免疫反應，與多種疾病的發生顯著相關[5]。因此，本研究以MASP1基因rs3774268和rs17040位點作為研究靶點，利用質譜技術對廣西扶綏縣壯族肝癌家系及正常家系的基因位點進行檢測，探討MASP1基因多態性與肝癌遺傳易感性的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 在廣西扶綏縣采集20個肝癌高發家系，由20例肝癌患者(肝癌組)，以及59例與患者有血緣關系的直系健康親屬(非肝癌組)組成。納入標準：肝癌高發家系成員均為廣西扶綏縣常住(全年在家居住6個月以上)壯族人群(三代以內均為壯族人群)；肝癌高發家系非肝癌組為與肝癌患者有直接血緣關系且未患肝癌的一級親屬(包括父母、子女、兄弟姐妹)和二級親屬(包括叔伯、堂兄弟姐妹)。肝癌組患者于2003年1月至2011年11月在廣西醫科大學附屬腫瘤醫院接受外科治療，術后經組織病理學確診為肝癌，且術前未行化療、放療或生物治療等；男17例,女3例；年齡28～65歲,中位年齡45歲；HbsAg(+)19例,HbsAg(-)1例；甲胎蛋白(+)13例,甲胎蛋白(-)7例；吸煙5例,不吸煙15例；飲酒2例,不飲酒18例。非肝癌組中，男28例,女31例；年齡16～86歲,中位年齡42歲； HbsAg(+)31例,HbsAg(-)28例；甲胎蛋白(+)1例,甲胎蛋白(-)58例；吸煙12例,不吸煙47例；飲酒12例,不飲酒47例。選擇與肝癌高發家系無血緣關系的40例扶綏縣居民為正常對照組。納入標準：與肝癌高發家系無血緣關系的扶綏縣人群(三代以內居住在扶綏縣)，且無肝炎病史、腫瘤病史及遺傳病史。正常對照組中，男26例,女14例；年齡16～85歲,中位年齡47歲；吸煙15例,不吸煙25例；飲酒17例,不飲酒23例。3組間性別、年齡比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究根據國家人類基因組研究倫理準則進行，所有選定者均簽署相關知情同意書。

1.2 相關定義 (1)吸煙：近期或以往吸卷煙100支或煙絲100 g以上；(2)飲酒：近期或以往每周飲酒至少1次,每次折合純酒精量>40 g,連續飲半年以上。

1.3 MASP1基因型分析

1.3.1 主要試劑及儀器：血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購自北京天根生物公司。Gold Reagent Kit試劑盒、MassARRAY Assay Designer 3.1軟件、MassARRAY Samsung Nanodispenser RS 1 000 nL點樣儀、MassARRAY Analyzer Compact質譜系統均購自美國Sequenom公司。質譜儀微陣列芯片SpectroChip、熱啟動Taq酶均購自美國Agena Bioscience公司。

1.3.2 DNA提取：采用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取肝癌組癌組織樣本、非肝癌組及正常對照組靜脈血液(無須空腹)樣本的DNA。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，提取后用分光光度計測定DNA的純度(A值為1.7～2.1)，置于-80℃冰箱保存備用。

1.3.3 引物設計與合成：采用MassARRAY Assay Designer 3.1軟件設計引物，各SNP位點均需要一條延伸引物和兩條PCR擴增引物，引物序列見表1。PCR擴增引物、單堿基延伸引物由深圳華大基因公司合成。

表1 引物序列

1.3.4 PCR擴增、引物延伸及芯片點樣：使用熱啟動Taq酶和引物常規擴增靶片段(40個循環)。在上述PCR產物中加入2 μL堿性酸化酶消化，以除去多余的脫氧核糖核苷三磷酸，消化程序：37℃ 60 min；85℃ 10 min。然后根據延伸反應程序執行單堿基延伸，并通過樹脂脫鹽純化產物。最后使用點樣儀將純化后的產物在質譜儀微陣列芯片SpectroChip上點樣。

1.3.5 檢測SNP位點：使用Mass ARRAY Analyzer Compact質譜系統實驗平臺對MASP1基因進行SNP分型，將已點好樣的SpectroChip放入質譜儀進行自動化檢測。檢測完成后用TYPER 4.0軟件分析實驗結果，獲得分型數據。通過引物延伸反應獲得的產物質譜峰的位置確定其分子質量以獲得分型結果。在質譜圖上，1種顏色可以對應2個或3個峰值，為SNP位點的延伸引物峰及兩個等位基因峰，若該位點屬于純合子，則僅存在1個等位基因峰,若為雜合子，則存在2個等位基因峰。

1.4 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析。計數資料以例數(百分比)表示。采用擬合優度χ2檢驗對各組基因型進行Hardy-Weinberg平衡檢驗[6]。采用非條件Logistic回歸分析計算各基因型和等位基因人群患肝癌風險的比值比(odds ratio,OR)及95%可信區間(confidence interval，CI)，校正因素為年齡、性別、吸煙、飲酒、HBsAg、甲胎蛋白。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 基因型檢測結果 MASP1基因rs3774268位點存在AA、GG和GA 3種基因型，其中AA基因型6例、GG基因型79例、GA基因型34例。rs17040位點存在CC、CT兩種基因型，其中CC基因型101例、CT基因型17例，非肝癌組中有1例未能檢測出rs17040位點的基因型。MASP1基因質譜圖見圖1。

圖1 MASP1基因rs3774268位點和rs17040位點質譜圖

注：圖A、B、C分別是rs3774268位點GG、AA、GA基因型的質譜圖；圖D、E分別是rs17040位點CC、CT基因型的質譜圖。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗 結果顯示,MASP1基因rs3774268和rs17040位點各基因型頻率與期望值吻合度較好(均P>0.05),各組具有人群代表性。見表2。

表2 MASP1基因rs3774268和rs17040位點基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗結果[n(%)]

2.3 MASP1基因rs3774268和rs17040位點多態性與肝癌易感性的關系 肝癌組與非肝癌組rs3774268和rs17040位點各基因型和等位基因頻率比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。肝癌組與正常對照組rs3774268位點的基因型頻率、rs17040位點各基因型和等位基因頻率比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)；而肝癌組rs3774268位點的A等位基因頻率高于正常對照組(P<0.05)。Logistic回歸分析顯示，經年齡、性別、吸煙、飲酒、HBsAg、甲胎蛋白校對后，rs3774268位點的A等位基因與肝癌的發生相關(P<0.05)。見表3及表4。

表3 MASPI基因rs3774268位點多態性與肝癌家系遺傳易感性的關系

表4 MASPI基因rs17040位點多態性與肝癌家系遺傳易感性的關系

3 討 論

補體系統是人體固有免疫系統的重要組成部分,可通過一系列絲氨酸蛋白酶的級聯酶解反應活化,其活化中間產物最終形成的攻膜復合物可發揮調節吞噬、化學趨化、介導細胞溶解、清除免疫復合物及細胞凋亡等功能[7]。人體可通過3種途徑(經典途徑、旁路途徑和凝集素途徑)激活補體系統。MASP1是補體激活途徑的重要組成部分，可影響機體免疫反應，與多種疾病的發生相關[4]。MASP1基因可通過前mRNA剪切編碼三種蛋白質-MASP1、MASP3、MAp44。MASP1蛋白是由699個氨基酸殘基和19個氨基酸殘基構成的前導肽，是一種通過快速自激活然后分裂MASP2來觸發凝集素途徑的酶[8]；MASP3蛋白由728個氨基酸殘基(包括19個氨基酸殘基)組成，可通過與MASP1或MASP2競爭結合凝集素途徑的模式識別分子來負調節補體系統，同時其還具有活化D因子的活性，而D因子是補體旁路途徑活化的關鍵酶[9]； MAp44也可通過與MASP1、MASP2、MASP3競爭結合凝集素途徑的模式識別分子來負調節補體系統[10]。研究表明MASP1基因rs3774275位點的多態性與肺結核的發生有顯著的相關性[11]；MASP1在神經膠質瘤[12]、原發性平滑肌肉瘤[13]中呈高表達，且血清高MASP1水平與宮頸癌進展和較差的疾病預后明顯相關[14]。但目前未見MASP1基因多態性與肝癌關系的相關文獻報道，因此，本研究分析了MASP1基因不同位點SNP與肝癌易感性的關系，以期能夠找到篩選肝癌高危人群的靶點，并為闡明肝癌發生的分子機制和預防提供實驗室依據。

本研究結果顯示，在正常人群中，rs3774268位點A等位基因個體罹患肝癌的風險是G等位基因個體的3.75倍(P<0.05)，但rs17040位點不同基因型及等位基因個體間罹患肝癌的風險比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。這提示MASP1基因rs3774268位點攜帶A等位基因者肝癌發生風險較高，而rs17040位點的SNP與肝癌高發家系遺傳易感性間無明顯相關性。

綜上所述，MASP1基因rs3774268位點的SNP與廣西扶綏縣壯族人群肝癌高發家系遺傳易感性存在關聯，而rs17040位點的SNP與廣西扶綏縣壯族人群肝癌高發家系遺傳易感性無關聯。由于本研究僅在廣西扶綏的壯族人群中進行，且樣本量較小，可能存在一定的選擇偏倚，之后需擴大樣本含量，并在不同地區和不同人群中進行更深入的研究。