黃蜀葵花總黃酮提取物中鞣質(zhì)的含量測(cè)定

張清華，崔 燕

（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

黃蜀葵花為錦葵科植物黃蜀葵Abelmoschus manihot(L.) Medic的干燥花冠。味甘，性寒，歸腎、膀胱經(jīng)。具有清利濕熱、消腫解毒的功效。用于濕熱壅遏，淋濁水腫；外治癰疽腫毒，水火燙傷[1]。黃蜀葵花在我國(guó)用藥歷史悠久，始載于宋代掌禹錫所著《嘉佑本草》，其后歷代本草均有記載。《嘉佑本草》記載黃蜀葵花“甘、寒、滑、無(wú)毒，主治小便淋及催生，治諸惡瘡、膿水久不痤者，作末敷之即愈，為瘡家要藥”。《本草綱目》記載：“其花氣味甘、寒、滑，無(wú)毒，主治小便淋及催生，消癰腫，浸油涂湯火傷”。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，黃蜀葵花中總黃酮具明顯的抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛、抗病毒及促進(jìn)愈合等藥理作用[2-7]，并可通過(guò)抑制心肌脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制心肌炎癥反應(yīng)，對(duì)缺血再灌注損傷的心肌發(fā)揮保護(hù)作用[8]。

由于鞣質(zhì)與黃酮類(lèi)物質(zhì)存在天然的生源關(guān)系，部分鞣質(zhì)具有與黃酮相似的結(jié)構(gòu)[9]，在黃蜀葵花總黃酮提取純化的過(guò)程中鞣質(zhì)類(lèi)成分也會(huì)有所富集。目前，針對(duì)黃蜀葵花及其提取物的質(zhì)量研究多集中于黃酮類(lèi)成分的控制，有關(guān)黃蜀葵花總黃酮中鞣質(zhì)類(lèi)成分的測(cè)定迄今未見(jiàn)報(bào)道。根據(jù)《藥品注冊(cè)管理辦法》中規(guī)定，藥材提取的有效部位制成的制劑要求“主要成分必須基本清楚”，為此，我們對(duì)黃蜀葵花有效部位總黃酮提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了較深入的研究，建立了提取物中鞣質(zhì)的含量測(cè)定方法，保證了黃蜀葵花總黃酮的質(zhì)量，為其進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 8453紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（安捷倫科技公司）；KQ2200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；XS-205電子天平（美國(guó)梅特勒-托利多公司）。

1.2 材料

沒(méi)食子酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110831-200302）；黃蜀葵花總黃酮提取物（自制，批號(hào)：20090227，20090313，20091212）；干酪素，無(wú)水碳酸鈉，福林酚試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取沒(méi)食子酸對(duì)照品約5 mg，精密稱(chēng)定，置10 ml棕色量瓶中，加70 %乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 ml中含沒(méi)食子酸0.1 mg）。

2.1.2 供試品溶液的制備 取黃蜀葵花總黃酮提取物約10 mg，精密稱(chēng)定，置25 ml棕色量瓶中，加70 %乙醇約20 ml，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，加70 %乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 總酚供試品溶液的制備 取上述供試品溶液4 ml，離心（7000 r/min）10 min，取上清，即得。

2.1.4 不被吸附的多酚供試品溶液的制備 精密量取上述供試品溶液20 ml，加至已盛有干酪素0.6 g的100 ml具塞錐形瓶中，密塞，置30 ℃水浴中保溫1 h，時(shí)時(shí)振搖，取出，放冷，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，備用。

2.1.5 干酪素溶液的制備 取干酪素粉末0.6 g，置100 ml具塞錐形瓶中，加入70 %乙醇20 ml，密塞，置30 ℃水浴中保溫1 h，時(shí)時(shí)振搖，取出，放冷，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，備用。

2.2 吸收波長(zhǎng)的選擇

精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0.5 ml，總酚供試品溶液和不被吸附的多酚供試品溶液各0.2 ml，干酪素溶液0.4 ml，分別置10 ml棕色量瓶中，分別加水2 ml，福林酚試劑0.5 ml，20 %碳酸鈉溶液1.5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，放置1 h。在400～900 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示，4種反應(yīng)液均在752±2 nm處有最大吸收，表明沒(méi)食子酸、鞣質(zhì)類(lèi)成分顯色后的產(chǎn)物有相同的吸收峰，故確定以752 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，分別置10 ml棕色量瓶中，分別加水2 ml，福林酚試劑0.5 ml，20 %碳酸鈉溶液1.5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，放置1 h。以相應(yīng)溶劑為空白，在波長(zhǎng)752 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)（y），對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=0.193 76x-8.6843×10-3（r=0.9996）。結(jié)果表明，沒(méi)食子酸在9.76×10-4～9.76×10-3mg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液（0.1 mg/ml）0.4 ml，置10 ml棕色量瓶中，加水2 ml，福林酚試劑0.5 ml，20 %碳酸鈉溶液1.5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，放置1 h。以相應(yīng)溶劑為空白，在波長(zhǎng)752 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)得沒(méi)食子酸吸光度的RSD為0.23 %。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取總酚供試品溶液及不被吸附的多酚供試品溶液各0.2 ml，分別置10 ml棕色量瓶中，加水2 ml，福林酚試劑0.5 ml，20 %碳酸鈉溶液1.5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，放置1 h。以相應(yīng)溶劑為空白，分別于配制后室溫下放置0，30，60，90，120，180 min時(shí)，在752 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)得吸光度的RSD分別為0.52 %，0.75 %（n=6）。結(jié)果表明，顯色后的總酚供試品溶液及不被吸附的多酚供試品溶液在180 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

2.6.1 供試品溶液的制備 取黃蜀葵花總黃酮提取物（批號(hào)20091212）約10 mg，共6份，分別精密稱(chēng)定，按2.1.2項(xiàng)方法制備供試品溶液。

2.6.2 總酚的測(cè)定 分別取上述供試品溶液4 ml，離心（7000 r/min）10 min，精密量取上清0.2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加水2 ml，福林酚試劑0.5 ml，20 %碳酸鈉溶液1.5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，放置1 h。以相應(yīng)溶劑為空白，在752 nm處測(cè)定吸光度，按沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚量。

2.6.3 不被吸附的多酚的測(cè)定 分別精密量取上述供試品溶液20 ml，加至已盛有干酪素0.6 g的100 ml具塞錐形瓶中，密塞，置30 ℃水浴中保溫1 h，時(shí)時(shí)振搖，取出，放冷，搖勻，濾過(guò)，分別精密量取續(xù)濾液0.2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加水2 ml，福林酚試劑0.5 ml，20 %碳酸鈉溶液1.5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，放置1 h。以干酪素溶液為空白，在752 nm處測(cè)定吸光度，按沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不被吸附的多酚量。

2.6.4 鞣質(zhì)含量計(jì)算 鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸附的多酚量，得樣品中鞣質(zhì)的平均含量為12.86 %，RSD為3.06 %（n=6）。結(jié)果表明本法具有較好的重復(fù)性。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的黃蜀葵花總黃酮提取物（鞣質(zhì)含量為12.86 %）5份，各約20 mg，精密稱(chēng)定，置100 ml棕色量瓶中，分別加入已精密稱(chēng)定的沒(méi)食子酸對(duì)照品約2 mg，加入70 %乙醇約70 ml，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，加70 %乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按2.6.2項(xiàng)方法測(cè)定總酚量；按2.6.3項(xiàng)方法測(cè)定不被吸附的多酚量；按2.6.4項(xiàng)方法計(jì)算鞣質(zhì)含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 3批黃蜀葵花總黃酮提取物鞣質(zhì)含量測(cè)定

取3批黃蜀葵花總黃酮提取物（批號(hào)：20090227，20090313，20091212），按2.1.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.6.2項(xiàng)方法測(cè)定總酚量；按2.6.3項(xiàng)方法測(cè)定不被吸附的多酚量；按2.6.4項(xiàng)方法計(jì)算鞣質(zhì)含量，3批樣品的鞣質(zhì)含量分別為13.03 %，14.37 %，12.58 %。

3 討論

3.1 本研究方法測(cè)定原理為酚類(lèi)物質(zhì)在堿性溶液中可將福林酚試劑中的鎢鉬酸還原（W6+變?yōu)閃5+），生產(chǎn)藍(lán)色化合物，顏色的深淺與酚含量成正相關(guān)[10]。因此可采用沒(méi)食子酸為對(duì)照品，福林酚試劑顯色，紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定總酚含量；用干酪素沉淀鞣質(zhì)，再以福林酚試劑顯色，測(cè)定不被吸附的酚類(lèi)物質(zhì)含量，二者之差即為鞣質(zhì)含量。

3.2 藥典中鞣質(zhì)含量測(cè)定采用磷鉬鎢酸試劑[1]，本研究采用福林酚試劑代替磷鉬鎢酸試劑，彌補(bǔ)了磷鉬鎢酸試劑配制過(guò)程較麻煩，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，且其他還原性性物質(zhì)有干擾的不足。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用福林酚/干酪素法測(cè)定黃蜀葵花總黃酮中鞣質(zhì)含量結(jié)果穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，且具有良好的精密度和準(zhǔn)確性，可用于黃蜀葵花總黃酮中鞣質(zhì)的含量測(cè)定，保證黃蜀葵花總黃酮的質(zhì)量。