玻璃酸二甲基硅烷醇酯對黏膜上皮細胞的保護作用

孟祥璟,張祥奎,陳建英,楊素珍，陳玉榮，劉少英，凌沛學,

（1.山東省藥學科學院 山東省生物藥物重點實驗室，山東 濟南 205101；2.山東福瑞達生物工程有限公司，山東 濟南 250101；3.山東福瑞達醫藥集團有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術重點實驗室，山東 濟南 250101）

玻璃酸又名透明質酸（hyalouronic acid， HA），它是構成皮膚、玻璃體、關節滑液和軟骨組織的重要成分，具有良好的潤滑性、黏彈性、高親水性和保濕性[1-2]，但也存在滲透性差、易降解、黏膩感較強等缺點[3]。玻璃酸二甲基硅烷醇酯（dimethyl silanol hyaluronate，DSHA）是一種HA酯化衍生物，具有保濕、消除黏濕感、抗降解及預防和修復皮膚損傷的作用[4]。研究發現HA能促進角質細胞的生長，從而增加表皮的厚度，提高皮膚的屏障功能，還可為創傷組織提供良好的微環境、促進創傷愈合[5]。DSHA不僅保留了HA優異的保濕效果，還更加穩定，可開發為化妝品原料或醫用原料[6]。

DSHA的保濕和隔離作用有助于清除鼻腔污物、消除異物感，使鼻黏膜功能恢復正常，緩解由于干燥環境、霧霾、粉塵、藥物刺激等造成的鼻腔干癢、灼熱、刺痛等癥狀，恢復鼻腔黏膜的自凈功能，預防和減少鼻炎的發生。本研究擬通過體外實驗檢測DSHA對兔鼻腔黏膜細胞的毒性，采用醋酸氯己定對兔鼻腔黏膜細胞和人陰道黏膜上皮細胞進行損傷，檢測不同濃度DSHA對黏膜的保護作用，為DSHA作為鼻腔黏膜保護劑的開發提供支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ClassII Type A2生物安全柜（北京東聯哈爾儀器制造公司）；HERACell 240i CO2培養箱（Thermo Scientific）；倒置相差顯微鏡（日本Nikon）；Tecan SUNRISE酶標儀（瑞士TECAN）；TS-2000 脫色搖床（北京市新技術應用研究所）。

1.2 試劑與耗材

DSHA（山東福瑞達生物工程）；醋酸氯己定（湖北遠成賽創科技公司）；DMEM 培養液，胎牛血清（美國Gibco）；胰蛋白酶-EDTA 消化液，噻唑藍（MTT，美國 Sigma）；CCK8試劑盒（美國MCE）；DMSO（上海生工）；肌肽（德國 Symrise公司）；透明質酸酶，膠原酶I，青霉素，鏈霉素（北京索萊寶）；其他為分析純化學試劑。

細胞培養板，培養瓶，培養皿，無菌離心管（美國 Corning）；0.22 μm無菌濾器（美國Millipore）。

1.3 動物與細胞

新西蘭家兔，體質量2.3～2.5 kg[山東省農科院畜牧獸醫研究所提供，實驗動物許可證號：SCXK（魯）2009-0013]；兔鼻黏膜上皮細胞（本實驗室分離培養）；人陰道黏膜上皮細胞VK2/E6E7（武漢大學細胞庫）。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 醋酸氯己定溶液制備 配制為10 mg/ml的乙醇溶液，使用時用培養液稀釋至0.01 mg/ml。

2.1.2 肌肽溶液制備 固體粉末用培養液溶解配制為4 mg/ml溶液并推濾除菌，使用時稀釋至2 mg/ml。

2.1.3 DSHA溶液制備 用DMSO溶解DSHA，配制為濃度為10 %的母液，用無血清培養液稀釋至1.25，0.25，0.05，0.01，0.002 mg/ml系列溶液。

2.2 兔鼻黏膜上皮細胞毒性試驗

耳緣靜脈空氣栓塞法處死新西蘭兔，從鼻中隔解剖兔鼻腔，75 %酒精消毒鼻腔內外，將鼻腔組織完全離斷，75 %醫用酒精浸泡消毒后，在超凈臺上分離鼻黏膜，剔除周圍的軟組織。仔細清除鼻腔表層，用刀片削下鼻黏膜并切碎為1～4 mm2小塊，放入預冷無菌含有雙抗（100 U/mL青霉素和100 μg/ml鏈霉素）的0.01 mol/L PBS液中，反復沖洗3～5次，將其放置在DMEM完全培養基中，37 ℃孵育0.5～1 h；再次用預冷無菌含雙抗的0.01 mol/L PBS清洗孵育，用預熱的混合消化酶（0.25 %透明質酸酶、0.05 %膠原酶I和0.05 %胰蛋白酶的混合液）消化40 min，以DMEM完全培養基終止消化。反復吹打消化液，靜止5～10 min，1500 r/min離心5 min，棄上清，然后加入DMEM完全培養基，重新懸浮細胞沉淀，將收集到的鼻黏膜細胞按接種于培養瓶。37 ℃、5 %CO2培養箱中培養。24 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁生長情況，每3 d換液一次。

將生長至對數期的細胞收集、計數后，稀釋至濃度為5×104個/ml，接種于96孔板，每孔100 μl，置于二氧化碳培養箱培養24 h，實驗組各孔分別加含DSHA的培養液100 μl（終濃度為1.25，0.25，0.05，0.01，0.002 mg/ml），陰性對照孔加不含DSHA的培養液100 μl。細胞給藥后培養24 h，加入CCK8溶液10 μl，避光，37 ℃孵育4 h，以不含DSHA的培養液200 μl+CCK8 10 μl為空白對照，波長450 nm處測定所有樣品孔孵育后溶液的吸光度值（A450）。

式中，A加藥為實驗組吸光度值，A陰性為陰性對照組吸光度值，A空白為空白對照組吸光度值。

2.3 兔鼻黏膜上皮細胞保護試驗[7]

取對數生長期兔鼻腔黏膜上皮細胞100 μl 接種于 96 孔培養板，細胞種植密度為5×104個/mL，置5 % CO2培養箱，37 ℃過夜培養，分為8組：空白對照組，細胞正常培養；陰性對照組，正常培養后用醋酸氯己定（終濃度0.01 mg/ml）處理1 h；陽性對照組，肌肽（2 mg/ml）共孵育后用醋酸氯己定（終濃度0.01 mg/ml）處理1 h；實驗組：用不同濃度（終濃度0.002，0.01，0.05，0.25，1.25 mg/ml）DSHA孵育后，用醋酸氯己定處理1 h。醋酸氯己定處理后，吸出孔內培養液，實驗組和陽性對照組分別繼續加入含不同濃度DSHA或肌肽的培養液，陰性對照組更新培養液但不添加受試物。37 ℃、5 %CO2培養箱培養20 h。然后每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，置培養箱內避光孵育4 h。吸棄上清，每孔加入DMSO 100 μl。避光，置搖床低速振蕩20 min，測定570 nm波長處吸光度值A，按下式計算細胞的相對增殖率。

相對增殖率（%）=（An-A0）/（Ay-A0）×100 %

式中，An為實驗組吸光度值，Ay為陰性對照組吸光度值，A0為空白對照組吸光度值。

2.4 人陰道黏膜上皮細胞保護試驗

按2.3項方法，將對數生長期人陰道黏膜上皮細胞VK2/E6E7用0.01 mg/ml醋酸氯己定處理1 h制備細胞損傷模型，參照2.3項實驗步驟以MTT法檢測細胞相對增殖率作為評價指標，檢測DSHA（濃度0.002～1.25 mg/ml）對人陰道黏膜上皮細胞的保護作用。

2.5 統計方法

3 結果與討論

3.1 DSHA對兔鼻黏膜上皮細胞增殖率的影響

結果見圖1。0.002～1.25 mg/ml濃度范圍內，DSHA處理組的細胞相對增殖率均＞98 %，隨著濃度的增大，未發現細胞相對增殖率有下降趨勢，表明DSHA無明顯細胞毒性。

圖1 不同濃度DSHA對兔鼻黏膜上皮細胞增殖率的影響（n=6）

3.2 DSHA對兔鼻腔黏膜上皮細胞的保護作用

結果見圖2、圖3。與陰性對照相比，提前進行藥物干預的細胞損傷后的修復狀態較好，細胞相對增殖率在60 %以上。其中，陽性對照組提前用2 mg/ml肌肽孵育細胞，對醋酸氯己定造成的損傷的修復效果與陰性對照組相比，差異具有高度統計學意義（P＜0.01）；試驗組提前用DSHA孵育細胞，藥物濃度大于0.01 mg/ml時，對醋酸氯己定造成的細胞損傷有修復效果，其中藥物濃度為0.05 mg/ml時，細胞相對增殖率與陰性對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），濃度為0.25，1.25 mg/ml時，與陰性對照組相比，細胞相對增殖率差異有高度統計學意義（P＜0.01）。濃度低于0.01 mg/ml的藥物修復效果較弱，細胞相對增殖率與陰性對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。由圖3可見，沒有使用醋酸氯己定損傷的細胞（C0）生長良好，陰性對照組（C-）有醋酸氯己定損傷，因無任何藥物干預，所以細胞生長狀況較差，陽性對照組（C+）有肌肽干預，所以細胞得到了明顯的修復。DSHA實驗組中，濃度為0.25 mg/ml時，細胞的修復效果最明顯；濃度為0.002 mg/ml時，細胞生長狀況不良，與陰性對照組相比，只有少量增殖。

圖2 不同濃度DSHA對兔鼻黏膜上皮細胞的保護作用（n=6）。

圖3 兔鼻腔黏膜上皮細胞損傷模型及不同處理組細胞形態

3.3 DSHA對人陰道黏膜上皮細胞的保護作用

結果見表1。使用醋酸氯己定對VK2/E6E7細胞進行損傷處理后，陽性對照組（肌肽）的細胞相對增殖率與陰性對照組差異有統計學意義（P＜0.05）。DSHA濃度＞0.01 mg/ml時可減弱醋酸氯己定對VK2/E6E7細胞的損傷作用，其中0.25，1.25 mg/ml組與陰性對照組的細胞相對增殖率差異有統計學意義（P＜0.05）。DSHA濃度低于0.05 mg/ml細胞相對增殖率與陰性對照組的差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 DSHA對VK2/E6E7的保護作用（n=6）

4 結論

本研究結果提示DSHA對兔鼻黏膜上皮細胞無毒性，先采用DSHA與細胞共孵育，能減輕醋酸氯己定損傷對黏膜細胞的刺激，對兔鼻腔黏膜上皮細胞和人陰道黏膜上皮細胞的微小損傷的恢復有顯著的促進作用。DSHA除保濕、潤滑作用外，可有效減輕外界因素對黏膜的刺激，恢復黏膜的正常功能，預防和減少相關疾病的發生，在鼻黏膜保護劑領域有廣闊的開發應用前景。