胃康散質量標準研究

莊偉香，李 輝，黃木土，李 冬，劉 珊，李 健

（1.中國人民解放軍南部戰區總醫院藥劑科；2.廣州市老年慢病患者合理用藥重點實驗室，廣東 廣州 510010）

胃潰瘍是臨床常見的消化系統疾病，致病因素較多，病理機制迄今尚未完全清楚[1-2]，近年消化性潰瘍的發病率逐年增長。中醫藥在治療胃潰瘍方面有淵源深厚的理論基礎和大量豐富的臨床實踐經驗，可發揮中藥多成分多靶點的作用優勢[3]。胃康散在我院一五七臨床部臨床應用多年，療效顯著，是由海螵蛸、白礬、白及、鐘乳石（煅）、兩面針、延胡索、甘草等藥材組成，出自《廣州部隊醫院制劑選編（1989）》，又名復方入地金牛散，主要用于制酸止痛，止血生肌，是治療活動性胃潰瘍的中藥制劑。處方中海螵蛸為君藥；白及為臣藥；兩面針、延胡索為佐藥，甘草為使藥。原質量標準中僅包括顯微鑒別法和化學反應法，處方中碳酸鈣等其他礦物質成分較多，不能追蹤該成分從藥材到制劑的轉移過程，而氯化兩面針堿僅存于兩面針中，其轉移過程易追蹤。因此，本實驗擬建新的質量控制方法，對處方中白及、延胡索、甘草進行薄層色譜（TLC）定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）測定處方中氯化兩面針堿的含量，為其進一步開發奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260系列，包括二元泵、自動進樣裝置、DAD檢測器、柱溫箱等），（美國安捷倫科技有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）水循環式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；HWS-28型恒溫電熱水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；KP03型超聲儀（廣州市科普超聲電子技術有限公司）。

1.2 藥品與試劑

胃康散（中國人民解放軍南部戰區總醫院自制制劑，批號：171130，170331，180424。規格：3 g）；白及對照藥材（批號：121262-201405），甘草對照藥材（批號：120904-201519），延胡索乙素對照品（批號：120928-201006），氯化兩面針堿對照品（批號：110848-200603）（中國食品藥品檢定研究院）；硅膠G薄層板（美國默克公司）；水為兩重蒸餾水，甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 定性分析

2.1.1 延胡索的鑒別 取胃康散3 g，加甲醇50 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 ml溶解，加濃氨試液調至pH 11～12[4-5]，用乙醚振搖提取3次，每次10 ml，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液[6]。另取延胡索乙素對照品適量，加適當甲醇制成1 mg/ml的對照品溶液。再按制備工藝，配制不含延胡索的陰性樣品，同供試品溶液配制方法制成陰性對照液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗[7]，吸取樣品溶液和陰性對照液各10 μl，對照品溶液2 μl，分別依次點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-三氯甲烷-甲醇（7.5:3.5:1）為展開劑（充分預飽和），室溫展開，上展約8 cm處，取出。晾干后置碘缸熏至斑點顯色清晰，約6 h后揮去板上吸附的碘后，置紫外燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同綠色熒光主斑點。陰性對照無干擾。見圖1。

圖1 延胡索TLC圖 （紫外燈下觀察）

2.1.2 白及的鑒別 取胃康散9 g，加70 %甲醇80 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 ml使溶解，用乙醚振搖提取2次，每次20 ml，合并乙醚液，揮至1 ml，作為供試品溶液[8]。取白及對照藥材0.5 g及缺白及藥材的陰性供試品9 g，同法制得白及對照藥材溶液和缺白及的陰性供試品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗[7]，吸取上述3種溶液各15 μl，依次點于同一硅膠G薄層板相應位置上，以環己烷-乙酸乙酯-甲醇（6:2.5:1）為展開劑，室溫展開，取出，晾干后噴以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，并且室溫放置數小時。供試品色譜中，日光下檢視在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的黃色斑點，陰性對照無干擾。見圖2。

圖2 白及TLC圖

2.1.3 甘草的鑒別 取胃康散5 g，加乙醇20 ml，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 ml使溶解，作為供試品溶液[9-11]。取甘草對照藥材2 g及缺甘草的陰性供試品5 g，同上法制得甘草對照藥材溶液和缺甘草的陰性供試品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗[7]。吸取供試品溶液和缺甘草的陰性供試品溶液各10 μl、甘草對照藥材溶液5 μl，分別依次點于同一硅膠G薄層板相應位置上，以三氯甲烷－甲醇－水（40:10:1）為展開劑（充分預飽和），室溫展開，取出。晾干后噴以10 %硫酸乙醇溶液，并在105 ℃條件下加熱至斑點清晰。供試品色譜中，日光下檢視在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相黃色的主斑點，陰性對照無干擾。見圖3。

圖3 甘草TLC圖

2.2 氯化兩面針堿的含量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent 5 TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1 %磷酸（用N,N-二乙基乙胺調pH值6.0）（60:40）；檢測波長：273 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；進樣量10 μl[12]。

2.2.2 對照品溶液 取氯化兩面針堿適量，精密稱定，置200 ml量瓶，加80 %甲醇制成76.1 μg/ml的對照品儲備溶液。用移液管精密吸取對照品儲備液5 ml至20 ml量瓶，加80 %甲醇稀釋至刻度，即得。

2.2.3 供試品溶液 取胃康散精密稱約10.0 g，樣品置100 ml錐形瓶，加入80 %甲醇30 ml，超聲處理30 min，室溫放冷，濾過至50 ml量瓶，并用80 %甲醇適量3次潤洗錐形瓶和濾紙，并定溶至刻度，搖勻后用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 按處方量配制不含兩面針的陰性樣品，再按2.2.3項下方處理，即得。

2.2.5 專屬性考察 分別取對照品、供試品和陰性樣品溶液各10 μl，以2.2.1項下條件進樣，結果見圖4，氯化兩面針堿約在6.3 min出峰，在該測定條件下，供試品中氯化兩面針堿峰與雜質分離度良好，陰性樣品中氯化兩面針堿出峰位置無雜質峰的干擾，方法專屬性好。

圖4 胃康散專屬性色譜圖

2.2.6 線性關系考察 分別精密取貯備液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 ml，置入10 ml量瓶，加80 %甲醇定容至刻度，得濃度依次為7.61，15.22，30.44，45.66，60.88，76.1 μg/ml的對照品溶液[13]。按2.2.1項下條件，精密吸取上述系列溶液各10 μl順次注入液相色譜儀。進行線性回歸分析，以氯化兩面針堿質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，得標準曲線為Y=54.67X-2.335，r=0.9995 （n=6），氯化兩面針堿在7.6～76.1 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.2.7 精密度試驗 按2.2.1項下色譜條件，精密吸取2.2.6項下濃度為45.66 μg/ml的氯化兩面針堿對照品溶液10 μl注入液相色譜儀，連續進樣6次，測定峰面積。其RSD為0.57 %，表明該系統及方法精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 取胃康散（批號：171130）適量，按2.2.3項下的方法制備供試品溶液，分別放置于第0，2，4、6，8，10，12，14，16，18 h進樣測定，記錄色譜峰面積并計算含量，得氯化兩面針堿峰面積RSD為0.93 %，表明樣品溶液在室溫放置條件下18 h內穩定。

2.2.9 重復性試驗 取胃康散（批號：171130）6份，精密稱定每份10.0 g，按2.2.3項下方法操作。再按2.2.1項下方法平行操作6次，該批號氯化兩面針堿的平均含量為82.73 μg/g，RSD為2.1 %，表明該系統和方法的重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密稱取胃康散（批號：171130）9份，每份約5.0 g，精密加入對照品貯備溶液適量，按2.2.3項下操作方法提取，再按2.2.1項下方法測定，計算平均加樣回收率。結果見表1。

表1 氯化兩面針堿加樣回收率試驗結果（n=9）

2.2.11 樣品含量測定 精密稱取胃康散3批（批號：171130、170331、180424）各適量，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，然后按所建方法進樣測定，計算樣品中氯化兩面針堿含量分別為0.2440，0.2972，0.2676 mg/袋。

3 討論

3.1 薄層鑒別

延胡索薄層色譜鑒別中，筆者參考《中國藥典》2015年版一部延胡索藥材薄層鑒別項下方法，發現上述條件展開效果尚可，但主斑點的分離效果欠佳，背景太深。隨后筆者比較了不同的展開劑系統正己烷-三氯甲烷-甲醇（7.5:3.5:1）、環己烷-乙醚-甲醇（3:5:0.5），結果以正己烷-三氯甲烷-甲醇（7.5:3.5:1）為展開劑，用碘蒸氣熏至各斑點顯色清晰，數小時（約6 h）揮盡板上吸附的碘后，在紫外燈（365 nm）下檢視，其斑點顯色清晰，且陰性樣品無干擾。白及的鑒別采用了《中國藥典》（2015年版）一部白及藥材的薄層鑒別方法，本次未加修改，其色譜圖中黃色斑點（比移值約0.385）為主斑點，陰性對照樣品也無干擾。本次甘草鑒別，其樣品采取超聲的方式進行提取，最后噴以10%硫酸乙醇溶液，并在105 ℃加熱至斑點清晰，立即置日光下檢視，樣品與甘草對照藥材色譜中的2個黃色斑點（比移值約0.255、0.375）為主斑點，其陰性對照樣品也無干擾。

3.2 HPLC含量測定溶劑提取的選擇

根據氯化兩面針堿[14-16]的化學性質，實驗中分別考察了（20 %、50 %、80 %）甲醇、乙醇，也嘗試了利用濃氨試液-甲醇（1:20）混合提取氯化兩面針堿[17]。結果以80 %甲醇、乙醇超聲處理30 min提取氯化兩面針堿，測定峰面積較大。綜合考慮，最終選定了80 %甲醇作為提取溶劑，其色譜圖雜質峰較少，與相鄰的色譜峰有很好的分離度。

3.3 HPLC含量測定中檢測波長及流動相的選擇

本研究的檢測波長，直接選擇了《中國藥典》2015年版一部兩面針藥材含量測定項下的檢測波長。流動相先后考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1 %磷酸水溶液、甲醇-0.1 %磷酸水溶液系統[18-21]，試驗過程中發現，氯化兩面針堿峰型較寬，存在拖尾現象，只有選擇甲醇-0.1 %磷酸溶液用作流動相，拖尾現象得以解決，分離效果好，但峰型較寬。隨后筆者將0.1 %磷酸水溶液pH值用N,N-二乙基乙胺調為6.0時，其色譜峰與其他雜質峰分離度最好，保留時間適中，峰形好，故本試驗流動相得以確定。