Picrophilus Torridus嗜熱酯酶的克隆表達及性質研究

杜曉韻，張興群*，張曉彥

（1.東華大學 化學化工與生物工程學院，上海 201620；2.華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 201620）

鄰苯二甲酸酯（phthalate ester，PAE），俗稱塑化劑，是廣泛使用的人工合成有機化學品，由于它具有提高塑料柔韌性、耐用性和可加工性的特點，被廣泛應用于工業生產和消費品中，如農藥、潤滑劑、化妝品及食品包裝袋。由于PAE與塑料不是共價鍵結合，所以在日常的生產、使用及廢物處理中，PAE很容易從塑料中滲透并進入環境中[1-2]。近年有報道顯示，一些污染工業區及電子廢棄物填埋場附近的土壤，被檢測出高含量的PAE[3]。這些高污染地點是PAE的重要污染源，隨著時間的推移，PAE會從外部環境中轉移到食物中，如從被污染的土壤或水中轉移到農作物中[4]。PAE在極低濃度下就會干擾人和動物的內分泌系統，長期的PAE污染，有致畸、致癌和致突變的風險。因此，許多環境組織把多種PAE列為優先污染物加以控制[5]。

PAE在自然環境中不易降解，依靠自然水解或光解來消除是不現實的。先進的氧化方式對于污水中的PAE降解是有效的，如光催化氧化、UV光解和臭氧氧化[3]，這些方法在近年都被證實能破壞污水中的PAE，但顯然不適用于土壤中PAE的降解。多位學者已從受污染的土壤污泥中篩選到能降解PAE的微生物，并認為降解PAE的最有效途徑為微生物介導[6]。微生物降解的本質是酶促反應，因此除了利用菌種本身對土壤進行修復外，提取微生物的降解酶類來進行降解也是一種有效的手段。外源投入的微生物或者降解酶是否能很好地作用于自然環境，是否會對自然環境造成額外的影響，這也是一個重要的研究方向[7]。

本研究以Picrophilus torridusDSM 9790基因組為模板，通過篩選，得到一個高對硝基苯酚丁酸酯（pNPB）水解活性的中度嗜熱酶，并對其基本酶學性質進行表征。以鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）為底物的初步降解實驗表明，0.1 mg該酶能在24 h內完全降解5 mmol/L的DBP，當溫度提高到60 ℃時，降解的效率提高。該酶可應用于一些高溫環境的土壤修復。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PCR擴增儀（Bio-rad公司）；EPS-300A電泳儀（天能科技）；生物電泳圖像分析系統（上海復日）；Sorvall Legend Micro 17冷凍離心機（Thermofisher scientific）；UV-1800紫外分光光度計，Prominence LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津）。

1.2 材料

1.2.1 菌株及載體E.coliBL21（DE3），E.coliDH5α和表達載體pET-28a(+)為實驗室所保存。Picrophilus torridusDSM 9790購自德國菌種庫DSMZ。

1.2.2 酶和主要試劑 擴增EstPt 1基因的引物由上海捷瑞生物公司合成，各種限制性內切酶，T4 DNA連接酶，LA Taq DNA聚合酶等分子生物學工具酶購自大連TaKaRa公司，細菌基因組DNA提取試劑盒，質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自北京天根生化，其他試劑均為國產分析純。

1.2.3 培養基 肉湯（LB）培養基（g/dL）：蛋白胨1.0，酵母粉 0.5，NaCl 1.0，pH 7.0；LB甘油培養基（g/dL）：甘油0.2，蛋白胨1.5，酵母粉0.75，NaCl 0.5，Na2HPO4·12H2O 1.26，KH2PO4 0.3，NH4Cl 0.1，MgSO41.2。

2 方法

2.1 EstPt 1基因的克隆及表達載體的構建

按NCBI公布的Picrophilus torridusDSM 9790嗜熱酯酶（NC_005877）基因序列設計引物，引物見表1，下劃線部分為引入的限制性內切酶EcoRI和HindIII酶切位點，根據細菌基因組提取試劑盒的說明提取Picrophilus torridusDSM 9790基因組DNA，以此為模板，進行常規PCR，擴增出嗜熱酯酶EstPt 1基因。將擴增產物與pET 28a(+)質粒連接，構建重組質粒pPtoE，并轉化到E.coliBL21（DE3）中，成功構建表達EstPt 1基因的菌株。

表1 克隆目的基因的引物

2.2 EstPt 1在大腸桿菌中的表達及純化

將重組菌接種到含50 mg/L 硫酸卡那霉素（Kan）的LB甘油液體培養基中，于37 ℃，200 r/min振蕩培養至OD600達0.4～0.6，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）， 37 ℃下誘導表達12 h，之后5000 r/min離心10 min收集菌體，重懸于10 ml預冷的PBS中，進行超聲細胞破碎（功率220 W，工作5 s，停3 s，99個循環），破碎液在4 ℃下10 000 r/min離心10 min，上清即為粗酶液。粗酶液過鎳柱進行純化，洗脫液為含100 mmol/L咪唑的PBS緩沖液，對收集到的液體用蒸餾水透析18 h，以去掉咪唑。對經透析的純酶液進行超濾濃縮，并采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測純度，純酶用于酶學性質分析。

2.3 酶活性測定

向2.97 μl 50 mmol/L PBS緩沖液（pH 7.0）中加入30 μl 1 mol/LpNPB母液，50 ℃保溫2 min，再加入適量的酶液，震蕩均勻。檢測波長405 nm，每隔10 s記錄一個A405值，記錄時長1 min[8]。根據以下公式計算酶活性。蛋白濃度通過Bradford方法測定[9]。

式中，?A405為A405值的變化量，t為反應時間。

2.4 EstPt 1酶學性質的研究

2.4.1 最適pH測定 配制不同pH值的緩沖液：pH 6～8 PBS緩沖液（50 mmol/L），pH 8～9.5 Tris-HCl（50 mmol/L）緩沖液。分別孵育10 min，以pNPB為底物，采用分光光度計測定純化后的酯酶活性，每個點重復測定3次。所有測定均于50 ℃進行。

2.4.2 最佳反應溫度測定 將純化得到的酯酶分別置于最適pH值下的4～95 ℃的反應體系中，分別孵育10 min，以pNPB為底物，采用分光光度計測定純化后的酯酶活性，每個點重復測定3次。

2.4.3 熱穩定性檢測 將純化后的酯酶置于60，65，70 ℃水浴中，定時取樣與底物pNPB反應，檢測酶活，每個點重復測定3次。

2.5 對DBP的降解反應

將DBP配制成50 mmol/L的母液，溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，取100 μl加入含900 μl PBS（pH 7.0）的玻璃小試管中，加入50 μl酶液，分別在37 ℃和60 ℃下避光反應。反應結束后，用等體積的乙酸乙酯萃取。萃取液用TLC點板分析。

2.6 TLC分析

用毛細點樣管取乙酸乙酯萃取液點樣，吹干后放入展開劑中展開。展開劑配方：石油醚:乙酸乙酯:乙酸（10:1:0.5），待展開劑展開到硅膠板前沿位置處取出，235 nm紫外燈下檢測。

2.7 HPLC分析

色譜柱：Inertsil ODS-SP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（80:20），檢測波長254 nm，柱溫40 ℃，流速0.8 ml/min。

3 結果與分析

3.1 EstPt 1基因在大腸桿菌中的表達

以Picrophilus torridusDSM 9790基因組DNA為模板，經PCR擴增得到906 bp的基因片段（見圖1），片段大小與預期相符，測序結果表明與NCBI（NC_005877）公布的基因序列一致。重組菌經IPTG誘導和SDS-PAGE蛋白質分析，在35 kD處有明顯的特異性表達條帶（見圖2），該條帶與預期結果一致，說明9790基因已成功表達。

圖1 重組質粒pPtoE PCR結果

圖2 誘導重組菌9790電泳結果

3.2 嗜熱酯酶EstPt 1的純化

經誘導的重組菌超聲上清經鎳柱親和層析和100 mmol/L咪唑洗脫，得到活性組分，經SDSPAGE分析，可得到單一的明顯的蛋白質條帶，說明100 mmol/L的咪唑可洗脫目標蛋白。對粗酶與純酶進行蛋白濃度和酶活檢測，結果見表2。純化倍數為3.09倍，純酶的比活達202.3 U/mg。

表2 EstPt 1純化結果

3.3 EstPt 1的酶學性質

3.3.1 EstPt 1的最適pH值 EstPt 1嗜熱酯酶的最適pH值范圍見圖3，由圖3可見，其最適pH值為9.0。pH是決定酶活力的重要因素，該酯酶在偏堿性條件下的活性高于酸性條件下活性。由于底物在≥pH 10的條件下會發生強烈的自水解，因此無法檢測。

圖3 pH對EstPt 1活性的影響

3.3.2 EstPt 1的最適反應溫度 溫度對于酶活力也有重要影響，見圖4。由圖4可見，隨著溫度上升，EstPt 1酶活力也逐漸升高，當溫度高于85 ℃時，酶活下降，所以最適溫度為85 ℃。酶在80～90 ℃間相對酶活超過90 %，且在0 ℃仍有16 %的活性，這說明EstPt 1不僅可在高溫下發揮作用，在低溫環境下也可很好地發揮作用。

圖4 溫度對EstPt 1活性的影響

3.3.3 EstPt 1的熱穩定性 熱穩定性是酶的一個重要參數，代表酶能在一定溫度一定時間內保持高效水解能力。由圖5可見，該酶在60 ℃保溫64 h，65 ℃保溫12 h，70 ℃保溫1 h，殘余活力均保持在50 %左右，表明EstPt 1具有良好的穩定性，可用于高溫環境中PAE的降解。

圖5 熱穩定性對比

3.4 EstPt 1降解塑化劑的應用研究

3.4.1 TLC分析結果 結果見圖6。由圖6可見，DBP分解產物為鄰苯二甲酸單丁酯（MBP），其在37 ℃下24 h可被基本降解。

圖6 EstPt 1與底物DBP反應24 h后的TLC結果

3.4.2 HPLC分析降解進程曲線 結果見圖7。由圖7可見，初始30 min內，底物消耗效率基本相同。此后，EstPt 1在60 ℃下對DBP的降解速度快于37 ℃下降解速度。反應2 h后，60 ℃和37 ℃下，底物殘留分別為5 %和28 %。 EstPt 1在高溫下對DBP降解活性較好，可用于一些高溫環境，如高溫堆肥，夏季蔬菜大棚內污染土壤的生物修復。

圖7 EstPt 1在37℃和60 ℃條件下對DBP的降解效果

4 結論

我們以Picrophilus torridusDSM 9790基因組DNA為模板，獲得了能降解PAE的嗜熱酯酶EstPt 1，該酶純化后的比活達到202.3 U/mg，其最適pH為9.0，最適反應溫度為85 ℃，具有良好的熱穩定性。

EstPt 1還顯示出對DBP良好的降解活性，TLC分析結果顯示，該酯酶可將DBP降解為單酯MBP；HPLC分析顯示，在37℃和60 ℃的溫度條件下，DBP在8 h內被完全降解，其中60 ℃下的作用效果較優。這對工業化降解環境中，尤其是高溫環境中的塑化劑降解有重要意義。