治療母豬子宮內膜炎中藥組合物的體外抑菌效果研究

劉洪明，郭 峰，周靈芝，楊 磊，孫汝江

（1.煙臺市農業綜合執法支隊，山東 煙臺 264000；2.棲霞市動物疫病預防與控制中心，棲霞 265300；3.煙臺開發區農業與海洋漁業局，煙臺 264006；4.煙臺海納生物技術研究所，煙臺 264000；5.中國農業大學煙臺研究院，煙臺 264000）

母豬子宮內膜炎是指母豬在配種、分娩及難產助產過程中因操作不當，導致細菌入侵引起子宮內膜感染的一種常見產科疾病，是母豬繁殖障礙綜合征的一種主要類型。本病的病因極為復雜，國內外學者將其大致歸結為原發的細菌感染、母豬患疾繼發細菌感染、公豬患疾引發母豬感染以及飼養過程中不嚴格執行操作規程等幾個方面。目前，各地均投入大量人力物力用于本病的防治，但發病率仍居高不下，歸根結底是因為本病病原繁多，且抗生素和消毒藥的不規范使用，極易導致耐藥性的產生，難以達到預期治療效果，即使能夠抑制細菌、病毒的繁殖，也無法清除病豬體內的毒素，使病豬出現病情反復、休克甚至昏迷死亡。本試驗研究一種治療母豬子宮內膜炎的中藥組合物體外抑菌效果，旨在為治療母豬子宮內膜炎提供一種新思路。

1 試驗材料

1.1 試驗時間與地點

試驗于2018年3—11月在煙臺海納生物技術研究所進行。

1.2 試驗菌液

大腸桿菌10株、金黃色葡萄球菌10株、無乳鏈球菌10株，均從已確診患子宮內膜炎的病豬分離制得。

將保存于斜面的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于普通瓊脂平板，無乳鏈球菌接種于血平板，37℃培養24 h；挑取數個大腸肝菌、金黃色葡萄球菌的菌落接種于MH肉湯，無乳鏈球菌接種于血清肉湯，37℃培養24 h，分別用滅菌生理鹽水稀釋，以0.5麥氏比濁管比濁，調其含菌量為1×108CFU/mL。然后再用滅菌生理鹽水將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌稀釋1 000倍，使其濃度為1×105～1×106CFU/mL備用。

1.3 中藥組合物

中藥組合物由以下成分混合均勻制備而成：海桐皮水提物4 g、老鶴草水提物1 g、透骨草水提物3 g、海風藤水提物1 g。中藥原藥材均購自煙臺市藥材公司。

海桐皮水提物、老鶴草水提物、透骨草水提物和海風藤水提物制備方法相同，具體為：將傳統煎煮法略作改進，生藥粉碎，顆粒度為20～200目，得生藥粉末，按藥水比 1∶15～25，得到浸膏，并制成粉末。

1.4 試驗動物

健康、清潔級昆明小鼠（20±2）g，雌雄各半，由山東省實驗動物中心提供，合格證號SYXK（魯）20140010。試驗開始前，于實驗室飼養7 d以了解其正?；顒忧闆r和健康狀況，適應本試驗環境。

2 試驗方法

2.1 小鼠致病性試驗

將大腸桿菌菌株、金黃色葡萄球菌菌株及無乳鏈球菌菌株分別接種于肉湯培養基，37℃培養24 h后作為供試菌液。每株菌的菌液通過腹腔途徑接種昆明鼠，0.5 mL/只，觀察結果。

2.2 抑菌作用測定

在表面均勻涂布供試菌液的瓊脂平板上打孔，每板3孔，孔徑6 mm，孔間距＞20 mm。將濃度為1 g/mL的單藥提取物和中藥組合物提取物溶液分別加于孔中，將接種大腸肝菌、金黃色葡萄球菌的瓊脂平板在37℃恒溫培養箱中培養18 h，無乳鏈球菌培養24 h，觀察結果，試驗重復3次。抑菌效果按照《中藥藥理學》的標準判定，抑菌圈直徑≥20 mm為極度敏感，14 mm≤抑菌圈直徑＜20 mm為高度敏感，10 mm≤抑菌圈直徑＜14 mm為中度敏感，10 mm以下為低度敏感[1-3]。

2.3 最小抑菌濃度測定

取滅菌試管10支，第1—9管中各加入無菌肉湯或血清肉湯培養基2 mL（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于肉湯培養基，無乳鏈球菌接種于血清肉湯），然后于第1管中加入1 g/mL的單藥或組合物溶液2 mL，混勻后取出2 mL加入第2管，依此類推，直到第8管中取出2 mL棄去，第9管為肉湯對照組，第10管為藥液對照組。分別于第1—9管加入供試菌液0.1 mL，搖勻，置37℃恒溫箱中培養18 h，不出現渾濁的最高藥物稀釋倍數為該藥的最小抑菌濃度（MIC）。

3 試驗結果

3.1 小鼠致病性試驗結果

小鼠接種后6～48 h全部死亡，剖檢、涂片染色、鏡檢，從小鼠體內分離到與接種菌株相同的細菌，表明這3種菌為母豬子宮內膜炎的病原菌。

3.2 抑菌圈直徑測定結果

中藥組合物對大腸桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別是（26.09±0.50）mm、（16.87±0.65）mm、（23.13±0.22）mm；4 種單藥對大腸桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑詳見表1。

表1 3株細菌的抑菌圈直徑測定結果 mm

3.3 最小抑菌濃度測定結果

中藥組合物對大腸桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）分別是31.25 g/L、31.25 g/L和15.625 g/L；4種單藥對大腸桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌的MIC詳見表2。

表2 3株細菌的最小抑菌濃度（MIC）測定結果 g/L

從試驗結果可以看出，中藥組合物對3種病原菌的抑菌圈直徑顯著大于4種單藥中任何一種單藥的抑菌圈直徑，且其MIC顯著小于3種單藥中任何一種單藥的MIC，由此可以證實中藥組合物對母豬子宮內膜炎病原菌的抑制作用強于海桐皮水提物、老鶴草水提物、透骨草水提物和海風藤水提物四者單用對母豬子宮內膜炎病原菌的抑制能力。

4 討論

本試驗通過4種具有抑菌抗炎作用的中藥聯合用藥，合理配伍、增效減毒，在體外對母豬子宮內膜炎致病菌有很好的抑制作用。試驗所用的中藥組合物包括海桐皮、老鶴草、透骨草、海風藤。方劑中的海桐皮，味苦、辛，性平，歸肝、腎經，具有祛風濕、通經絡、殺蟲止痛等功效?，F代藥理研究表明，海桐皮有鎮靜鎮痛、抗潰瘍、抗缺氧等作用，主治脹滿下疾、溫病發熱，熱毒癰瘍和腫瘤等癥。老鶴草，味苦、微辛，性平，歸肝、腎、大腸經，能祛除風濕，常用于風濕痹痛。老鶴草提取物的滅菌水溶液在體外對福氏痢疾桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌均有抑制作用。透骨草，味甘、辛，性溫，入肺、肝二經，有活血化瘀、利尿解毒、通經透骨之功效，對于一身上下，心腹腰膝，內外各種疼痛，均可選用該品治之，取其辛溫善走，活血利氣之功，血氣通則不痛。海風藤，味辛、苦，性微溫，歸肝經，能祛風濕、通經絡、止痹痛，用于風寒濕痹，肢節疼痛，筋脈拘攣，屈伸不利。

本中藥組合物的配伍原則是“增效減毒”，方中海桐皮、透骨草活血止痛，海風藤、老鶴草溫經散寒，四藥相伍，全方得以標本兼治、扶正祛邪，全面調整、平衡陰陽。各藥相伍，共同達到活血止痛、溫經散寒的作用，且調整體內氣血運行，可以快速緩解病豬疼痛等癥狀，修復子宮內膜。中藥組合物對母豬子宮內膜炎病原菌的抑菌圈直徑大于4種單藥中的任何一種，而最小抑菌濃度則小于4種單藥中的任何一種，因而可證實中藥組合物對母豬子宮內膜炎病原菌的抑制作用強于4種單藥水提物分別對母豬子宮內膜炎病原菌的抑制作用之和。