豬流行性腹瀉免疫抗體的ELISA檢測及其與瓊脂擴散試驗相關性分析

潘孝成，芮聰杰，沈學懷，趙瑞宏，戴 銀，胡曉苗，侯宏艷，周學利，張丹俊

（1.安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省畜禽疫病研究中心，合肥 230031；3.安徽農業大學動物科技學院，合肥 230061）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，為單股正鏈有囊膜的RNA病毒，其可導致豬的一種以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為特征的傳染病，尤其哺乳仔豬受害最嚴重，1971年首次在英國發現豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）[1]，我國內地自20世紀80年代初以來陸續有關于PEDV分離和鑒定的報道[2]，2010年底開始，PED在我國呈暴發性流行，2011—2012年流行面積進一步擴大，疫情繼續蔓延，一些地區流行較為嚴重[3-5]，2013年、2014年豬流行性腹瀉更是肆虐全球，美國、墨西哥、中國臺灣、日本、加拿大、多米尼加共和國、哥倫比亞、秘魯、韓國、烏克蘭等國家和地區也相繼暴發豬流行性腹瀉疫情[6-7]，給世界養豬生產者造成巨大的經濟損失。近年來豬流行性腹瀉在我國呈現常態化，在秋、冬、春季十分常見，其危害仍然較重[8]。

目前，我國對豬流行腹瀉的防控主要是采用疫苗免疫，市場上的商品化疫苗主要有豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗和活疫苗以及豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒病三聯活疫苗3種，其中所用豬流行性腹瀉病毒的毒株不盡相同，各家豬場對豬流行腹瀉的免疫采用疫苗和免疫程序也不完全相同。本研究對不同地區的5家規模豬場的母豬初乳的豬流行性腹瀉病毒IgA抗體水平進行了ELISA檢測分析，并對流行性腹瀉病毒抗體的ELISA和瓊脂擴散試驗（瓊擴試驗）檢測結果的相關性進行了研究，旨在為豬流行性腹瀉防控提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2019年1—3月在安徽省農業科學院畜牧獸醫所/安徽省畜禽疫病研究中心進行。

1.2 主要試劑和材料

豬流行性腹瀉病毒IgA抗體ELISA檢測試劑盒，韓國安捷公司Bionote公司生產（生產批號：EB4410PO）；豬流行性腹瀉病毒瓊擴抗原，安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所獸醫研究室制備并保存。

1.3 樣本采集和處理

采集免疫過豬流行性腹瀉疫苗的母豬初乳樣本，用1.5 mL高壓滅菌消毒離心管自哺乳期母豬身上采集產后3 d內的初乳樣本，每頭豬采集不少于500 μL乳汁，共采集樣本數為454份，來自5家大規模豬場，分別是河南省漯河市源匯區和信陽市平橋區的2家豬場，安徽省定遠縣和肥東縣的2家豬場，江蘇省泗洪縣的1家豬場。將乳汁樣本4℃12 000 r/min離心3 min，取上清液，低溫保存備用。

1.4 ELISA檢測

按照豬流行性腹瀉病毒IgA抗體ELISA檢測試劑盒說明書，對所有采集母豬初乳的PEDV IgA抗體進行檢測。1）檢測的有效性：陰性對照平均OD450值（NCX）≤0.200，陽性對照平均 OD450值（PCX）≥0.500，上述任何一個值超出規定的范圍，則該試驗被視為無效，所檢的樣品需要重新進行檢測。2）判斷值=0.35+NCX。3）陽性結果：樣品OD450值＞判斷值；陰性結果：樣品OD450值＜判斷值。

1.5 瓊擴檢測

用濃度0.01 mol/L、pH為7.4的PBS配制濃度1%的瓊脂糖凝膠，制備瓊擴平板，瓊脂糖凝膠厚度為5～6 mm之間，用七孔梅花打孔器打孔。將瓊擴抗原加入到7孔中的中間孔，將待測抗體做等比稀釋，稀釋倍數分別為 2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6，依次加入到周圍 6 孔中，加入瓊擴抗原和待測抗體的量均為30 μL/孔，將瓊擴平板于37℃溫盒中反應24 h，讀取瓊擴抗體效價。

2 結果

2.1 不同豬場母豬乳汁中IgA抗體水平

收集來自河南、安徽、江蘇的5家大型豬場454份初乳樣本，將豬場分別命名為AK、XHZ、BD、MQ、NA，這5家豬場生產母豬免疫豬流行性腹瀉疫苗次數，除BD場為產前3次，其余為產前2次（4/5），見表1，不同豬場所用疫苗生產廠家和疫苗毒株也不盡相同。用豬流行性腹瀉病毒IgA抗體ELISA檢測試劑盒進行檢測，結果顯示，5家豬場初乳中PEDV IgA抗體陽性率均較高，陽性率分別為94.00%、97.06%、98.00%、98.21%和100%，陽性率最高的是XHZ場，最低的是MQ場。XHZ和MQ場其母豬免疫次數相同，產前的第1次免疫時間不同；XHZ用的是PEDV活疫苗和滅活苗的組合；MQ全部用的是滅活苗免疫。5家豬場初乳中PEDVIgA抗體陽性平均OD450值分別為1.858 8、1.979 0、2.013 6、2.047 3和2.148 0，差異不顯著（P＞0.05），PEDV IgA抗體陽性平均OD450值最低的是生產母豬免疫次數最多的BD場，最高為AK場，見表2。

表2 不同豬場母豬初乳中PEDV IgA抗體ELISA檢測結果

2.2 ELISA與瓊擴相關性檢測結果

為建立PEDV抗體的ELISA與瓊擴檢測相關性，選擇ELISA檢測為PEDV IgA抗體陽性的初乳樣本，按OD450值大小分組用瓊擴法檢測PEDV抗體并分析，所用PEDV瓊擴抗原為本實驗室制備的高濃縮純化抗原，每組檢測初乳樣本數為5個或6個。結果顯示，OD450值≤1.0的組別瓊擴抗體檢測全部為陰性，OD450值為 1.1～1.4、1.5～1.8、2.1～2.7 和≥3.0的4個組別所測得瓊擴幾何平均效價分別為1∶4.5、1∶12.1、1∶32 和 1∶36.8，可以看出抗體瓊擴幾何平均效價與PEDV IgA ELISA抗體檢測試劑盒檢測所得的OD450值存在正相關性，即ELISA檢測OD450值高的，其瓊擴幾何平均效價則相對較高。具體見表3。

表3 乳汁PEDV抗體的ELISA與瓊擴相關性檢測結果

3 討論

PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，各種年齡的豬都能感染發病，尤其哺乳仔豬受害最嚴重，發病率可達100%，病死率平均為50%，10日齡內哺乳仔豬死亡率可高達90%，斷奶豬、肥育豬、母豬和種公豬雖然發病率也可達100%，但大多數病豬可康復，一般表現為持續4～6 d的水樣腹瀉，基本不出現死亡[3，9]。大量研究表明，初生仔豬主要通過母豬初乳中IgA抗體而獲得PED的被動免疫保護，因此母源抗體中IgA抗體水平高低對保護初生仔豬抗PEDV感染極為關鍵[10-11]。

本研究對來自安徽、河南、江蘇的5家大型豬場免疫母豬初乳中PEDV IgA抗體水平進行了檢測，初乳抗體陽性率均較高，陽性率為94.00%～100%，陽性樣品平均OD450值分別為1.858 8～2.148 0。從結果分析可知，生產母豬的免疫次數、疫苗種類和疫苗生產廠家對生產母豬初乳中PEDV IgA抗體水平無明顯影響。胡興義等[10]研究表明，產前采用豬流行性腹瀉三聯活疫苗和二聯滅活疫苗交替免疫的方式，比產前均用豬流行性腹瀉三聯活疫苗或二聯滅活疫苗進行兩次免疫效果更好。王艷豐等[11]研究表明，生產母豬產前豬流行性腹瀉三聯活疫苗和二聯滅活苗組合使用，其初乳抗體平均陽性率（97.79%）高于生產母豬產前豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗二次免疫組（90.69%）。結合本研究及胡興義等[10]、王艷豐等[11]研究結果，我們認為生產母豬產前進行一次豬流行性腹瀉活疫苗（豬流行性腹瀉三聯活疫苗或豬流行性腹瀉二聯活疫苗）加一次豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗免疫，這可能是較為合理的豬流行性腹瀉產前免疫方式。

瓊脂擴散試驗是一種常用的抗體檢測方法，其具有操作簡便、成本低廉和儀器設備要求低等特點，適宜于基層獸醫和養殖場等使用。本研究結果表明抗體瓊擴幾何平均效價與PEDV IgA ELISA抗體檢測試劑盒檢測所得的OD450值呈正相關性，雖然PEDV IgA ELISA檢測陽性且OD450值≤1.0的組別瓊擴抗體檢測全部為陰性，但OD450值≤1.0的陽性樣本數只占到總陽性樣本數4.30%（數據結果中未列出），因此用瓊擴法開展豬流行性腹瀉病的免疫抗體評價一定程度上可用于替代ELISA法，這具有重要的現實意義。