一株豬源產超廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

張青嫻，徐引弟，王治方，朱文豪，許 峰，王克領

（1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養調控重點實驗室，河南 鄭州 450002）

β-內酰胺類抗生素為目前臨床使用率很高的抗生素，約占抗生素總使用量的30%～40%。近年來，隨著β-內酰胺類抗生素的廣泛應用，細菌尤其革蘭氏陰性菌迫于生存壓力對其耐藥性已經產生，耐藥菌株逐年增多，且呈交叉耐藥和多重耐藥之趨勢[1]。β-內酰胺類抗生素耐藥的主要機制是能產生超廣譜 β-內酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases,ESBLs），且ESBLs細菌攜帶ESBLs質粒的同時可能帶有對喹諾酮類、氨基糖甙類和磺胺類等藥物的多種耐藥基因，使其具有多重耐藥表型，給臨床治療帶來嚴重的威脅，成為臨床關注的焦點[2-4]，大腸埃希氏菌和克雷伯氏菌是ESBLs的主要攜帶者[5]。

為指導獸醫臨床合理用藥，促進養殖業的發展，筆者于2018年3月對河南省農業科學院畜牧獸醫研究所傳染病研究室分離得到的大腸桿菌，進行了ESBLs的基因型檢測。經分離培養和PCR檢測等方法，確認為TEM型ESBLs大腸桿菌，現將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2018年3月，本實驗室采集河南省某豬場發生腹瀉的仔豬病料，經組織培養、革蘭氏染色、分離純化和PCR檢測等方法分離到3株大腸桿菌。

1.1.2 主要試劑、培養基等 麥康凱（Mac conkey,MC）瓊脂、普通營養瓊脂、革蘭氏染色液等試劑購自北京奧博星生物公司。藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。Taq PCR master mix、DL 2 000 DNA Marker、GoldView等PCR試劑購自寶生物（大連）有限公司。膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA提取試劑盒等購自上海生工生物有限公司。頭孢他啶（CAZ）及頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/CA），頭孢噻肟（CTX）及頭孢噻肟/克拉維酸（CTX/CA）等藥敏紙片、M-H（Muller-Hinton Medium）瓊脂培養基購自杭州濱和微生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分離鑒定 將采集的病料無菌接種MC培養基，置于37℃溫箱培養18 h后，挑取單個玫紅色菌落做革蘭氏染色鏡檢，將疑似大腸桿菌的單菌落接種于普通營養瓊脂培養基中純培養后做PCR鑒別試驗。用于鑒別大腸桿菌的上游引物P1：5′-ATGA AAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3′，下游引物 P2：5′-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3′，擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.2 藥敏試驗

（1）紙片擴散法初篩ESBLs表型。將過夜培養的受試菌（菌液濁度0.5麥氏單位）均勻涂布于無菌M-H瓊脂培養皿上，同時貼上頭孢他啶CAZ（每片含 30 μg）、頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/CA，每片含 30 μg/10 μg）、頭孢噻肟 CTX（每片含 30 μg）、頭孢噻肟/克拉維酸（CTX/CA，每片含 30 μg/10 μg），各紙片中心距20～25 mm；37℃過夜培養，分別測量抑菌環直徑。任意一組加克拉維酸比不加克拉維酸的抑菌環直徑≥5 mm即可確認為ESBLs陽性菌株。

（2）檢測ESBLs陽性菌株的藥物敏感性。采用K-B法測定ESBLs分離菌株對常用抗菌藥物的敏感性。所選藥敏紙片包括7大類18種抗生素：阿米卡星（AK）、四環素（TE）、氨芐西林（AMP）、阿莫西林（AMX）、卡那霉素（K）、氧氟沙星（OFX）、頭孢噻呋（EFT）、恩諾沙星（ENR）、頭孢唑林（CZ）、復方新諾明（STX）、新霉素（N）、頭孢哌酮（CFP）、氟苯尼考（FFC）、鏈霉素（S）、慶大霉素（GM）、環丙沙星（CIP）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢噻肟（CTX）。

1.2.3 PCR基因分型 參考GenBank中大腸桿菌ESBLs耐藥基因相關序列，設計4對引物如下，CTX-M 基因：F 5'-AAAAATCACTGCGCCAGTTC-3'，R5'-AGCTTATTCATCGCCACGTT-3'；TEM 基因：F5'-CATTTCCGTGTCGCCCTTATTC-3'，R 5'-CGTTCATC CATAGTTGCCTGAC-3'；SHV 基因：F 5'-AGCCGCTT GAGCAAATTAAAC-3'，R 5'-ATCCCGCAGATAAAT CACCAC-3'；OXA 基因：F 5'-ATGAAAAACACAAT ACATATCAACTTCGC-3'，R 5'-GTGTGTTTAGAATGG TGATCGCATT-3'。

將純培養后的菌液提取DNA作為PCR模板，分別按如下反應體系進行PCR擴增，13 μL Taq PCR master mix、5 μL dd H2O、1 μL P1（上游引物）、1 μL P2（下游引物）、5 μL 模板。PCR 反應程序為：94℃變性5 min→94℃ 50 s→50～56℃退火45 s→72℃ 40 s，共30個循環，72℃延伸10 min。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 耐藥基因序列比對 將陽性PCR產物回收后提取質粒，送至上海生工生物工程有限公司測序，將測出的基因序列用DNAStar的MegAlign軟件與NCBI上相關TEM序列比對，構建系統進化樹。

2 結果

2.1 分離培養結果

分離菌株經革蘭氏染色鏡檢，可在視野內見到典型的或短或長的革蘭氏陰性短桿菌（圖1），經PCR鑒別試驗得到的陽性菌株可在264 bp處得到目的條帶（圖2）。結果從肺臟、氣管和心血中各培養出1株大腸桿菌，將3株大腸桿菌做ESBLs表型和基因分型測定。

圖1 分離株的鏡檢結果（1 000×）

圖2 分離株的PCR鑒定

2.2 藥敏試驗結果

紙片擴散法結果從3株大腸桿菌中篩選出心源性大腸桿菌為ESBLs菌株，將該菌株命名為HB01株。藥敏結果顯示該菌株對7大類17種藥物均耐藥，耐藥譜為K+N+S+GM+OFX+ENR+CIP+TE+AMP+AMX+STX+FFC+CZ+CFP+EFT+CAZ+CTX，只對氨基糖甙類藥物阿米卡星敏感。

2.3 PCR基因分型結果

對菌株HB01做ESBLs耐藥基因分型試驗，結果只擴增出1條與預期大小一致的TEM型ESBLs基因片段，而沒有擴增出CTX-M、SHV、OXA型ESBLs基因片段（圖3）。

圖3 分離株TEM基因擴增

2.4 耐藥基因序列對比結果

TEM耐藥基因測序后，用BLAST在線比對以后，下載相關序列，其信息見表1。

表1 HB01株比對的相關序列信息統計

圖4 HB01株的TEM基因系統進化樹

如表1和圖4所示，HB01株與GenBank上相關TEM基因同源性達99%，即該分離株與人類糞便和尿液、禽類肝臟和糞便、豬糞便、狗陰囊液及未使用過的導尿管等分離株的同源性均為99%，提示了該菌株的耐藥基因可能在寵物、人、畜禽以及醫用器材之間的轉移和傳播。該耐藥基因與狗源最接近，提示應注意人畜共患病的危險。

3 討論

隨著抗菌藥物選擇性壓力不斷增大，以及獸醫臨床上抗菌藥物的不規范使用，促進了攜帶ESBLs基因質粒的轉移，致使ESBLs菌株檢出率大幅提高，我國產ESBLs豬大腸桿菌的流行呈逐年上升趨勢[6-10]。Yuan等研究表明產ESBLs菌的多重耐藥程度顯著高于非產ESBLs菌，流行的耐藥基因以CTX-M和TEM基因型為主[11-15]。本試驗所分離到的產ESBLs豬大腸桿菌耐藥性很強，常用的7大類抗生素只對阿米卡星敏感，其耐藥基因是TEM型，與國內眾多學者研究結果一致。

本研究表明，該分離株的遺傳基因與畜禽、人及寵物間同源性非常接近，這不得不引起科研工作者的重視。耐藥基因在被污染的土壤、水源、畜禽之間和以及畜禽與人之間互相轉移的現象，是否已呈流行趨勢，這使得公共衛生面臨嚴峻挑戰。

細菌的耐藥性可通過染色體或質粒介導在細菌間傳播和擴散[16-17]，且耐藥性增強導致的潛在危害能在動物和人之間交叉感染。Johnson等[18-19]在貓狗中檢出與人相關的ST131表現出相似的耐藥性和毒力因子。王影等[20]的研究發現，雞源與人源大腸桿菌共同攜帶的耐藥基因gyr B、sul2、TEM和flo R的同源性均高于97%。Thorsteinsdottir等[21]的研究也證實E.coli普遍存在的耐藥性可以從動物傳播到人，動物與人源大腸桿菌可能攜帶同一耐藥基因，耐藥基因可能在雞源與人源大腸桿菌中水平傳播，進而導致耐藥性的傳播，致使個別超級耐藥菌株出現。

本試驗進一步說明豬源ESBLs的耐藥性相當普遍，耐受譜呈復雜和增大趨勢。作為高熱綜合征的病原體之一，豬源ESBLs在公共衛生學上的重大意義，使我們不得不重視目前的耐藥現狀。臨床和生產中應按照一定時間分離豬群ESBLs，并及時對其做藥物敏感性試驗，合理安排藥物配伍，盡可能減少用藥，降低ESBLs耐藥性的產生和傳播。

在目前的研究基礎上，應更保守地使用現有抗生素，加強產酶耐藥菌的監測和研究，以及通過投資激勵研究人員精準研究、嚴格合理應用抗生素。此外，疫苗、噬菌體療法和微生物組操縱等非抗生素的治療方法，正受到日益廣泛的關注。這些都可以有效防止產ESBLs大腸桿菌病的暴發和流行。