一種透射電鏡痕量生物樣品制樣方法的介紹

曲寶清 張翠萍 張 琪

(北京市神經外科研究所 首都醫科大學附屬北京天壇醫院，北京 100070)

透射電鏡技術是生物學、醫學研究和臨床診斷的重要方法。其中有些樣品數量少、體積小且相對分散，給樣品制備帶來困難。以細胞樣品的特點為例，如體外培養的細胞和來源于外周血及骨髓的細胞等，都是數量較少，難以成團。在繁瑣的樣品制備過程中即便是細胞團塊也極易碎裂或分散。另外還有一類小體積樣品，無法離心成團，如：擬南芥根尖。以往實驗室多用明膠預包埋法處理這類樣品，該方法的明膠溫度難以控制，操作不便[1]。針對上述樣品的特點本實驗室采用包裹法對細胞樣品進行簡單處理，既保證了樣品原有數量，又不影響包埋效果。本文以體外培養的Vero細胞和擬南芥根尖為例對這種方法做一詳述。

1 材料和方法

1.1 樣品的收集和固定：

用橡膠細胞刮輕輕刮下Vero細胞，以1500 rpm/min的離心速度，離心處理10min，使細胞成團[2,3]，細胞數量不少于105個。離心處理后用塑料移液管吸出上清液，使用0.1M磷酸鹽緩沖液或砷酸鹽緩沖液清洗，加入4℃預冷的戊二醛固定液，并于4℃固定2h。注意添加液體需沿離心管壁緩慢加入，盡量不要將細胞團塊沖散。

用上述固定方法固定、洗滌擬南芥根尖，擬南芥根尖一般大小約1mm，注意吸液體時不要用力過大使樣品丟失。

細胞和擬南芥根尖樣品如圖1所示。

圖1 Vero細胞和擬南芥樣品。A圖為細胞樣品，在離心管底部可見一小塊細胞團；b圖為擬南芥根尖，樣品大小約1mm。

1.2 樣品的包裹處理

包埋前對細胞樣品做特殊的包裹處理。準備一支新塑料移液管，將其尖端部分剪掉一小段，便于較大的細胞團塊進出。

將普通擦鏡紙剪成邊長為1cm的小片(如圖2所示)，平放于體式顯微鏡載物臺上，用剪掉尖端的移液管吸取細胞團塊或擬南芥根尖，滴加在擦鏡紙中心，借助體式顯微鏡觀察，并用眼科鑷輕輕將擦鏡紙四邊折起即可(如圖3所示)。

圖2 擦鏡紙和滴加樣品a圖為修剪厚度擦鏡紙，1cm大小；b圖為a圖在掃描電子顯微鏡下觀；c圖為用剪掉尖端的移液管將樣品滴加至擦鏡紙中心。

圖3 樣品包裹圖示。a圖折疊樣品示意圖；b圖用剪掉尖端的移液管將樣品滴加至擦鏡紙中心；c～f圖依次折起擦鏡紙四邊折起

1.3 后固定和包埋

本實驗室使用組織包埋處理機Leica EM TP進行包埋。將上述包裹好的細胞樣品置于組織籃中(見圖4)，即可以按常規進行后續鋨酸固定、乙醇脫水、環氧丙烷置換，Epon 812樹脂浸透等處理。包埋時需仔細觀察樣品情況，經鋨酸后固定后，樣品呈現黑色，對于擬南芥根尖樣品可以小心打開紙包，按照需要的包埋方向進行包埋。對于細胞樣品，如有明顯的細胞團塊，可以在打開擦鏡紙后用鑷子輕輕托取團塊轉移入包埋板或者膠囊；如觀察不到明顯的細胞團塊，則無需去除擦鏡紙，直接轉移入包埋板包埋即可。將包埋板置于烤箱，37℃過夜，60℃聚合24小時。

圖4 包裹后樣品入籃

1.4 樣品后續常規超薄切片制備和染色

待樹脂聚合后，對上述樣品進行常規修塊、超薄切片制備、檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色。使用日立透射電子顯微鏡H-7650對樣品超薄切片進行觀察和拍照。

2 結果觀察

在電鏡下觀察擬南芥樣品的超微結構清晰，鋨酸后固定和樹脂浸透良好。小細胞團容易在電鏡下進行觀察和拍照。對于數量較低的細胞樣品可見單個細胞散布于擦鏡紙纖維的間隙中間，可對其進行觀察和拍照，如圖5。

圖5 電鏡超微結構a圖為擬南芥根尖低倍超微結構圖，可見結構完整；b圖為擬南芥根尖高倍超微結構，可見樹脂浸透良好，細胞器結構清晰；c圖為透射電鏡下Vero細胞超低倍照片，可見細胞散在分布；d圖為Vero細胞高倍照片，可見細胞固定良好，樹脂浸透均勻，超微結構清晰(a, c, Bar=5μm; b, Bar=1μm; d, Bar=2μm)。

3 注意事項

3.1 貼壁細胞收集

建議貼壁培養的細胞盡量使用細胞刮下的處理方式，以保證細胞的形態不發生改變。胰酶消化也是常用的收集細胞的方法，但是經胰酶消化后的細胞突起回縮，胞體趨于圓形，對鏡下的觀察有一些影響。

3.2 細胞的離心

不要因為樣品量少使用過高的轉數離心。離心力過大可能導致細胞變形，并使細胞超微結構產生假象。細胞離心速度控制在1500rpm/min以內，離心10min即可[2]。

3.3 細胞轉移和洗滌

從細胞收集到入包埋板，細胞團需要經過幾次轉移，轉移過程中切記動作輕緩。不要用鑷子夾取，較大細胞團塊可以用鑷子托取，較小團塊可用塑料移液管轉移。注意塑料移液管剪掉尖端，以免過于狹窄卡住細胞團塊，塑料移液管不要反復吹打細胞團，盡量一次吸完。細胞洗滌時添加液體注意沿管壁緩慢添加，切勿將團塊沖散。向擦鏡紙滴加細胞懸液時注意一滴一滴添加，每添加一滴后，等液體滲透出擦鏡紙，再滴加下一滴，以免液體量過大，將細胞沖出擦鏡紙。

3.4 細胞包裹紙張的選擇

對于紙張的選擇，應選具有一定吸水能力，占體積小，盡量薄，不影響浸透，還需要柔軟，以便于折疊。基于上述考慮，擦鏡紙是較好的選擇。

4 討論

“明膠包埋法”雖然可以準確定位到需要的部位，但需注意包埋樣品的瓊脂不能太厚，明膠的溫度也難以控制，操作很不方便。“紙巾包裹法”與“明膠包埋法”相比較操作簡單，大大提高了工作效率，同時又有效地避免了組織處理過程中樣品的丟失，是一種易于操作和掌握的方法。但是需要注意的是，在每次漂洗時需注意吸管或槍頭的尖端不要扎破擦鏡紙，否則樣品會從破洞中漏出，在每一步的清洗過程中會造成“損耗”。總之，對于痕量生物樣品而言，包埋前對樣品的包裹處理是一種簡便有效的處理方法。

5 結論

透射電鏡生物樣品制備過程時間長，程序復雜，對于體積微小、分散的生物樣品，其制備難度大，對于這類樣品需要進行特殊處理[3]。雖然傳統方法能獲得理想的包埋效果，但是本文經過改良后的樣品包裹法更加簡單快速，不僅操作方便，易于掌握，更能克服大量樣品在多次漂洗過程中的“損耗”，尤其是對于珍貴的生物樣品，不但保證了樣品的數量，也獲得了高質量的電鏡圖片。