基于蛋白質組學和液相色譜-三重四級桿/線性離子阱串聯質譜測定魚糜制品中的大豆過敏原蛋白

(1.衢州檢驗檢疫局綜合技術服務中心 ， 衢州 324000；2.浙江工商大學 ， 杭州 310018 ；3.溫州大學 ， 溫州 325035)

1 引言

魚糜制品是指以生鮮魚或者冷凍魚為原料，加入食鹽等輔料經擂潰、斬拌、成型、凝膠化等加工過程形成具有一定彈性的凝膠狀食品的總稱[1]，如魚腸、魚糕、模擬蟹肉等海鮮產品[2]。因其高蛋白、低脂肪、營養價值高、味道鮮美等優點而深受消費者的喜愛，進一步提高其經濟價值[3]。魚糜制品在加工時為提高其口感和凝膠強度，通常會加入一定量的蛋白質作為彈性增強劑，主要有大豆蛋白、乳清蛋白、雞蛋清蛋白等[4]。而這些蛋白恰恰是引起食物過敏常見的食物種類。據統計，全球約8%兒童和約2%成年人對食物過敏，食物過敏已成為威脅人類健康的主要問題之一[5]。避免食用含有過敏原的食物是目前唯一有效的預防辦法，為幫助易感人群遠離食物過敏，歐盟、美國、澳大利亞、新西蘭等國家相繼采取食品中過敏原強制標識技術貿易措施[6，7]，也對我國魚糜產品出口造成巨大影響，因標簽不符合進口國要求而被通報及退運等往往使中國食品出口企業在過敏原這道壁壘上受挫[8]。

目前，檢測食品中大豆過敏原成分主要兩種方法：基于抗體的酶聯免疫吸附法(ELISA)[9，10]和基于DNA的聚合酶鏈式反應(PCR)方法[11，12]。但ELISA方法靈敏度不高且存在交叉作用，容易導致假陰性或假陽性結果；PCR技術是基于DNA的檢測手段，而不能直接檢測致敏蛋白，故限制了它們在食物過敏原中的應用[13]。現階段，有人嘗試將蛋白質組學與液質聯用技術相結合的方法對蛋白質進行定性定量分析。Boo[14]等利用LC-MS/MS同時檢測餅干中雞蛋、牛奶、花生中的過敏蛋白，檢出限低至5mg/kg。Planque M[15]等人利用液質聯用方法定量多種復雜基質中過敏原蛋白，其中大豆過敏原蛋白檢出限為5mg/kg。Na Lin[16]等利用同位素標記的多肽作為內標，提高了方法的準確性。液質聯用技術因其高靈敏度、特異性能準確的定性定量分析復雜食品基質中的蛋白含量。蛋白的液質檢測方法是基于對胰蛋白酶水解產生的肽段進行檢測，該肽段具有特異性且能滿足定量分析目標蛋白的要求。該方法的關鍵之處是在于篩選出目標蛋白的一個或者更多的特征肽段。在這個策略基礎上，本研究合成了大豆過敏蛋白Glycinin G2的特征肽段來定性定量分析魚糜制品中大豆蛋白的含量。

目前，對于魚糜制品中大豆過敏原蛋白的液相色譜-三重四級桿/線性離子阱串聯質譜方法未見報道，本研究采用MRM-IDA-EPI采集模式，當多反應監測信號超過設定的閾值時，儀器會被觸發交替進行多反應監測和增強子離子掃描，在一次進樣過程中既可以采集到多反應監測譜圖，也可以采集到增強子離子二級譜圖，通過譜庫檢索達到同時定性和定量的目的。

2 材料與方法

2.1 試劑

二硫蘇糖醇(DTT)、碳酸氫銨(NH4HCO3)、碘乙酰胺(IAA)(分析純)購自美國Sigma-Aldrich 公司；甲酸(FA)(HPLC級)購自美國Tedia 公司；乙腈(ACN)(HPLC級)購自德國Merck 公司；胰蛋白酶(測序級，比活度>8000 units/mg protein)購自美國Sigma-Aldrich 公司。Tris-HCL購置Bio-Rad公司。

鳙魚購自杭州農貿市場；大豆分離蛋白粉來購自Bio-Rad；安井牌魚丸、安井牌魚豆腐、丸之尊魚豆腐、安井牌仿蟹柳、海霸王牌魚丸、海霸王魚豆腐、海霸王牌蟹柳均購置于杭州永輝超市。

特異肽段標準品EAFGVNMQIV購自上海強耀生物科技有限公司，純度均大于95%；超純水由Milli-Q超純水凈化系統制備，其他試劑均為分析純級別。

2.2 儀器設備(表1)

表1 主要儀器信息

2.3 液相條件與質譜條件

2.3.1液相條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；柱溫: 40 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：0.15%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度洗脫色譜分離條件

2.3.2質譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測(MRM)；電噴霧電壓：5500 V；霧化氣壓力：30 Pa；氣簾氣壓力：55 Pa；輔助氣壓力：55 Pa；離子源溫度：550 ℃；去簇電壓：95 V。大豆過敏蛋白特異肽段標準品質譜參數表3；EPI參數：當MRM響應值大于100 CPS時同時啟動線性離子阱的增強子離子掃描功能；增強子離子掃描范圍：200～1000 Da；掃描速度10000 Da/s；動態填充時間15 ms。

表3 多反應離子監測參數

注：帶*為定量離子。

2.4 標準儲備液的配制

分別精密稱取2.5 mg大豆過敏蛋白特征肽段EAFGVNMQIVR 于5mL容量瓶中，用20%乙腈～80% 0.15%甲酸水溶解定容，配制成500 μg/mL的特征肽段標準品儲備液。置于-20 ℃冰箱保存，保質期為6個月。

2.5 樣品預處理

2.5.1蛋白提取

將買來的魚清洗除內臟，剔除魚皮和魚骨，絞碎，分裝于-20℃冷藏。稱取2 g處理好的魚肉，加入5 mL 0.2M Tris-HCL,于60℃振蕩2 h，振幅200，冷卻至室溫。8000 rpm/min 10min，取上清液待用。

2.5.2酶解

取500μL上清液，加10μL 500mmol/L DTT，56 ℃水浴加熱30min。然后加入30μL 500mmol/L IAA，室溫下避光靜置30min之后，加入胰蛋白酶(1∶50，w/w，酶與底物濃度比)，在37 ℃水浴中酶切16h。加入5μL 甲酸終止反應，于10000rpm/min 離心10min。上清液過0.22μm濾膜，上機測定。

2.6 計算公式

2.6.1基質效應的評價

將處理好的魚肉作為空白基質，精密移取一定量的特征肽段EAFGVNMQIVR儲備液，分別用初始流動相和空白基質酶解液稀釋配制成1、5、10、20、50 ng/mL標準曲線溶液，基質效應計算公式如下：

式中：slopematrix為空白基質曲線的斜率；

slopestandard為標準曲線的斜率。

2.6.2 魚糜制品中過敏蛋白含量的計算公式

式中：X—魚糜樣品中大豆過敏原蛋白的含量，μg/g；

m—魚糜樣品質量，g；

δ—樣品的稀釋倍數；

c—樣品中特異肽段的含量，ng/mL；

V—樣品酶解的體積， mL；

M1/M2—大豆過敏蛋白與特征肽段的相對分子質量比值

2.6.3加標回收率

回收率實驗是空白魚糜酶解液中加入低、中、高3個水平的特征肽段，經過LC-MS/MS檢測，計算得出結果。回收率的計算公式如下：

回收率%=(C-A)/B×100%

式中：A為供試品中被測組分含量，ng/mL;

B為加入的特異肽段的含量，ng/mL；

C為實際樣品中組分值，ng/mL。

3 結果與討論

3.1 特異肽段的篩選

大豆球蛋白(Glycinin)是大豆抗原蛋白中免疫原性最強的因子之一，約占大豆籽實蛋白總量的40%[17]。Glycinin G2 由485個氨基酸組成，分子質量為54391 Da，主要引發免疫蛋白Ig E介導的Ⅰ型過敏反應[18]，且耐熱，是大豆過敏蛋白的研究熱點。

建立準確定量分析蛋白質的液質聯用分析方法，特征肽段的選擇至關重要。本方法在查閱相關文獻的基礎上[14,19-25]，篩選出2條大豆的特征肽段后進行實際樣品的驗證(見表4)。通過液質聯用技術得到2條肽段的母離子質荷比信息(圖1)，從液質圖中可以看出，2條大豆過敏蛋白肽段響應值高，靈敏度好。

表4 大豆過敏蛋白選擇肽段初篩

圖1 2條大豆過敏蛋白肽段的色譜圖(5%大豆添加)

同時，考慮到b/y離子類型的肽段比a/x型相對更穩定，因此在滿足實驗靈敏度和經濟成本的前提下選擇EAFGVNMQIVR(氨基酸序列位置228-238，相對分子質量1263.49)肽段作為大豆特征肽段，相應的特征肽段標準品二級質譜圖見圖2。

3.2 質譜參數及譜庫的建立

3.2.1質譜參數優化

本研究采用針泵注射大豆蛋白過敏原多肽，在正離子模式下進行一級母離子掃描，得到準分子離子峰[M+2H]+,然后進行子離子掃描得到二級碎片，根據獲得的碎片信息建立多反應監測離子對，在多反應監測模式下優化化合物去簇電壓、碰撞能量，優化后參數見表3。同時對線性離子阱參數進行優化及設置，參數為當MRM響應值大于100 CPS時同時啟動線性離子阱的EPI掃描功能；EPI掃描范圍：200～1000 Da；掃描速度10000 Da/s；動態填充時間15 ms。

圖2 特征肽段的二級質譜圖

3.2.2譜庫建立

本研究采用MRM-IDA-EPI掃描譜庫檢索模式。首先從MRM模式獲得化合物的保留時間、峰面積等信息，在利用EPI掃描獲得的二級質譜圖進行譜庫檢索。將標準溶液采集到的EPI譜圖通過Access編寫導入液質數據庫，作為標準譜庫。對實際陽性可疑樣品進行檢測，用采集到EPI譜圖進行譜庫檢索。根據purity值進行排序，purity越接近100%，檢測到的陽性可疑樣品為目標化合物的可能性越大。

3.3 方法學驗證

3.3.1基質效應

液質聯用技術是對質荷比進行檢測，因此目標化合物的離子化程度是檢測靈敏度的關鍵。與純溶劑相比，基質的存在能不同程度的影響化合物的電離，抑制或增強其電離的響應信號值。因此實驗測定了空白基質的基質效應，結果如圖3所示。實驗將基質效應(ME)范圍在0.9～1.1之間的認定為基質效應忽略不計，ME小于0.9的為基質效應抑制作用，ME大于1.1的為基質效應增強作用。結果表明，ME=73.5%(見圖3)，對特異肽段有明顯的抑制作用，表明空白基質的存在對特異肽段的檢測存在一定程度的干擾，因此后續實驗采用基質加標曲線來補償基質效應，使實驗結果更接近真實情況。

圖3 溶劑與空白基質的標準曲線

3.3.2方法的線性關系、LOQ和LOD

分別精密移取特征肽段儲備液，用空白魚糜酶解液稀釋成0.5、1、5、10、20、50、100、200 ng/mL的標準溶液，以特征肽段的濃度為橫坐標(X)，色譜峰面積為縱坐標(Y)做線性回歸方程，該方法的線性方程為：Y=14895X-38916，R2=0.9975。

常用信噪比法確定檢出限與定量限，以空白魚糜酶解液作為基質，添加特征肽段儲備液，以該肽段的信噪比為3相應的濃度確定檢出限，而以信噪比為10相應的濃度確定定量限。結果顯示，該方法中魚糜制品中大豆過敏原蛋白的定量限為0.108 μg/g。

3.3.3加標回收率、精密度

空白魚糜酶解液中添加低中高(1、5、50 ng/mL)3個濃度特征肽段標準品，得到的峰面積通過工作曲線計算其回收率。結果如表5所示，加標回收率在78.2～108.3% ，相對標準偏差不大于5.9%。

表5 空白魚糜樣品加標回收率和精密度

3.4 實際應用

采用模擬加樣的方式，大豆分離蛋白的添加水平設置為1%、2%、5%，同時，采用市售的7個魚糜制品作為實際樣品進行檢測，采用基質加標曲線計算含量值，結果見表6。

從檢測的實際樣品結果可知，其中丸之尊魚豆腐的配料列表中不含有大豆分離蛋白，但仍檢測出大豆過敏原， 其含量在0.87 μg/g。對陽性樣品進行EPI掃描譜庫檢索確認為大豆過敏蛋白多肽。圖4為實際樣品的EPI譜圖譜庫檢索結果。

表6 實際樣品中大豆過敏原蛋白含量

圖4 實際樣品增強子離子掃描譜圖譜庫檢索結果

4 結論

本實驗建立液相色譜-三重四級桿/線性離子阱串聯質譜法快速靈敏的檢測魚糜制品中痕量大豆過敏原蛋白的分析方法。通過蛋白組學bottom-up方法成功篩選出大豆過敏蛋白的特征肽段，并采用MRM-IDA-EPI掃描譜庫檢索方法建立了靈敏度高、特異性強、檢出限低的定性定量方法，其定量限達到0.108 μg/g，回收率在78.2～108.3%。對于魚糜制品中痕量的大豆過敏原蛋白的準確定性定量方法的建立，不僅能為食品標簽的規范化提供理論參考，還能避免過敏人群受到傷害，具有很大的現實意義。