茚三酮比色法測定湘西臘肉甘氨酸含量*

鄧湘波 鄧湘平

1（郴州市食品藥品檢驗檢測中心，湖南郴州 423000）2（郴州市蘇仙區食品藥品監督管理局，湖南郴州 423000）

臘肉是一種歷史悠久的中式傳統肉制品。臘肉種類繁多，主要根據地域性進行分類。湖南湘西臘肉的風味、色澤是我國眾多臘肉品種中比較突出的,是湖南臘肉中的優質產品，也是西部民族地區飲食文化的特色之一。

湘西臘肉因其獨特的配方和工藝，形成了湘西臘肉獨特的味香和口感。對于風味性食品，食品的揮發性化合物決定了香氣特性并對食品的特征風味貢獻最大。肉類產生芳香揮發物質的主要反應是氨基酸和還原糖之間發生美拉德反應和脂質熱降解,其主要反應有:氨基酸和肽熱降解、糖降解、硫胺素熱降解、類脂類物質氧化作用以及不飽和脂肪酸雙鍵斷裂。研究鑒定食品的揮發性風味化合物已成為食品科技人員的重要任務。湘西臘肉作為一種典型的風味性食品，研究臘肉中氨基酸含量，對其揮發性風味成分的研究具有重要意義。

甘氨酸（Gly）又名氨基乙酸，為人體非必需氨基酸。甘氨酸是氨基酸系列中結構最簡單，組成蛋白質的20 多種氨基酸中的一種。目前甘氨酸被廣泛應用于醫藥、食品、農藥等領域。在湘西臘肉中，由于其特有的加工工藝及湘西黑豬原材料，使甘氨酸在湘西臘肉中的含量遠遠大于其他食品。

目前，氨基酸的檢測方法有很多，主要有氨基酸自動分析儀法（GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》、GB/T18654.11—2008《養殖魚類種質檢驗第11 部分：肌肉中主要氨基酸含量的測定》和高效液相色譜法QB/T 4356—2012《黃酒中游離氨基酸的測定》）。雖然都是國家推薦分析方法，但這些方法前處理均較繁雜，同時要求的儀器設備費用高，操作相對繁瑣。本研究采用紫外分光光度計，用茚三酮比色法測定湘西臘肉中甘氨酸含量，該方法操作簡單，儀器設備要求低，具有普遍的可行性。利用茚三酮在一定條件下與甘氨酸顯色的原理，重點研究了溶液pH、顯色劑用量、乙醇用量、加熱溫度、加熱時間和冷卻時間對茚三酮比色法定量檢測甘氨酸的影響，效果較為滿意，可供臘肉中甘氨酸含量檢驗檢測提供參考。并在線性范圍內建立測定標準曲線，通過分光光度法對其定量測定。

1 試驗部分

1.1 試驗儀器與試劑

1.1.1 試驗儀器

S220 酸度計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-9000S 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；ML204 電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.1.2 試驗試劑

甘氨酸，優級純；茚三酮、95%乙醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉，均為分析純。

1.1.3 試驗原料

從湖南湘西地區的吉首市瀘溪縣、花垣縣、保靖縣、古丈縣、永順縣、龍山縣等7 市縣隨機抽取小作坊和工廠加工的臘肉產品（主要為背部肉部分）各2 份，共計14 份樣品，置于清潔塑料袋內送回試驗室檢測。

1.2 溶液的制備

1.2.1 甘氨酸標準溶液的制備

精密稱取0.200 g 甘氨酸于燒杯中，加適量水溶解，轉移至1 L 容量瓶中，定容至刻度，作標準儲備液備用。

1.2.2 顯色劑的制備

精密稱取2.0 g 茚三酮，加入30 mL 乙醇溶液，低溫加熱溶解后，轉移至100 mL 容量瓶中，冷卻后，用乙醇定容至刻度，置于0 ℃～5 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 緩沖溶液的制備

0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液：準確稱取28.4 g 磷酸氫二鈉，加蒸餾水溶解，轉移至1 L 容量瓶中定容，備用。

0.1mol/L 檸檬酸溶液：準確稱取21.01 g 檸檬酸（C6H8O7H2O)，加蒸餾水溶解，轉移至1 L 容量瓶中定容，備用。

2 方法與結果

2.1 樣品前處理

準確稱取干燥后粉碎的樣品2.0 g，置于燒杯中，加入20 mL 蒸餾水混勻，然后加入10 mL 6 mol/L 的鹽酸溶液和5 g 活性炭，在沸水浴中加熱水解1.0 h，然后將水解溶液轉移至110 ℃±1 ℃過夜，用30 mL 熱蒸餾水洗滌活性炭，收集濾液于100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻備用。

2.2 檢測波長的選擇

分別移取1 mL pH 值為6.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液于7 支25 mL 比色管，依次加入3 mL 0.2 mg/mL 的甘氨酸鈉標準溶液和1.0 mL 2.0%茚三酮乙醇溶液，置入90 ℃水浴加熱15 min，室溫下以70%乙醇溶液定容至25 mL，放置20 min 后以空白溶液作參比測量不同波長下的吸光度，結果見下頁圖1。

2.3 最佳反應條件的選擇

2.3.1 反應pH 的選擇

圖1 最大吸收波長選擇

分別取2.0 mL 甘氨酸標準溶液于7 支25 mL 比色管中，管中分別加入1.0 mLpH 為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的磷酸氫二鉀-磷酸二氫鈉緩沖鹽溶液和2.0 mL2.0%茚三酮溶液，5 mL 乙醇溶液，于100 ℃水浴加熱15 min，冷卻10 min，用水定容至刻度。在568 nm 處測定不同條件下顯色體系的吸光度，結果見圖2。

圖2 pH 對甘氨酸溶液吸光度的影響

由圖2 可知，甘氨酸溶液在pH 為7.0 處有最大吸光度，即甘氨酸與茚三酮的顯色反應適宜在弱酸環境下進行，這與文獻報道相吻合。

2.3.2 顯色劑用量的選擇

分別取3.0 mL 甘氨酸標準溶液于7 支25 mL 比色管中，加入1.0 mL pH7.0 的緩沖鹽溶液，5 mL乙醇溶液，分別加入1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、1.7 mL、2.0 mL、2.2 mL、2.5 mL2.0%茚三酮溶液于100 ℃水浴加熱15 min，冷卻10 min 用水定容至刻度。在568 nm處測定不同顯色體系的吸光度，結果見圖3。

由圖3 可知，隨茚三酮顯色劑用量的增加，溶液的吸光度先增大后趨于平衡，在顯色劑用量為2.0 mL 時溶液的吸光度接近最大值，繼續增加顯色劑用量，甘氨酸溶液的吸光度不再發生明顯變化，從取樣和節省顯色劑方面考慮，確定2.0 mL 為最佳茚三酮溶液用量。

2.3.3 乙醇用量的選擇

圖3 顯色劑用量對甘氨酸溶液吸光度的影響

分別取3.0 mL 甘氨酸標準溶液于5 支25 mL 比色管中，加入1.0 mLpH6.0 緩沖溶液，2.0 mL2.0%茚三酮溶液，分別加入1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、10.0 mL95%乙醇溶液，于100 ℃水浴加熱15 min，冷卻10 min，用水定容至刻度，在568 nm處測定顯色體系吸光度，結果見圖4。

圖4 乙醇用量對甘氨酸溶液吸光度的影響

由圖4 可知，隨著乙醇用量的變化，溶液的吸光度先增大后減小，在用量為5 mL 時溶液的吸光度達最大，故5 mL 乙醇用量為最佳。

2.3.4 加熱溫度的選擇

分別取3.0 mL 甘氨酸標準溶液于5 支25 mL 比色管中，加入1.0 mLpH7.0 的緩沖鹽溶液，2.0 mL 2.0%茚三酮溶液，5 mL95%乙醇，分別于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴加熱15 min，冷卻10 min，在568 nm 處測定顯色體系的吸光度，結果見圖5。

圖5 加熱溫度對甘氨酸溶液吸光度的影響

由圖5 可知，隨著溫度的升高，溶液的吸光度不斷增加，為使樣品反應更加充分，因此選用100 ℃作為最佳加熱溫度。

2.3.5 加熱時間的選擇

取3.0 mL 甘氨酸標準溶液于5 支25 mL 比色管中，加入1.0 mLpH7.0 的緩沖鹽溶液，2.0 mL2.0%茚三酮溶液，5 mL95%乙醇，分別于100 ℃水浴中，加熱5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，在568 nm 處測定顯色體系的吸光度，結果見圖6。

圖6 加熱時間對甘氨酸溶液吸光度的影響

由圖6 可知，加熱15 min 時甘氨酸溶液達到最大吸光度。

2.3.6 冷卻時間的選擇

分別取3.0 mL 甘氨酸標準溶液于6 支25 mL 容量瓶中，加入1.0 mLPH7.0 的緩沖鹽溶液，2.0 mL 2.0%茚三酮溶液，5 mL95%乙醇，于100 ℃水浴加熱15 min，分別冷卻4 min、6 min、8 min、10 min、12 min、14 min，在568 nm 處測定顯色體系的吸光度，結果見圖7。

圖7 冷卻時間對甘氨酸溶液吸光度的影響

由圖7 可知，冷卻10 min 時甘氨酸溶液有最大吸光度。

2.4 甘氨酸標準曲線的繪制

吸取2.0 mL 樣品溶液及2.0 mL 不同濃度的甘氨酸系列標準溶液于比色管中，分別加入5.0 mL pH 為6.0 的緩沖鹽溶液，充分搖勻后，加入2.0 mL質量濃度為2.0%的茚三酮顯色液，5.0 mL 乙醇，搖勻，于沸水浴中加熱15 min，冷卻10 min 定容，用1.0 cm 比色皿，以零管調節零點，于波長568 nm 處測定吸光度，繪制標準曲線。同時做空白試驗。甘氨酸標準曲線如圖8 所示。

圖8 甘氨酸標準曲線

由圖8 可知，甘氨酸溶液質量濃度在0 μg/mL～50 μg/mL 范圍內呈線性關系，其回歸方程為：y=0.011 6 x+0.006 2，相關系數R2=0.999 4，空白試樣質量濃度為0.14 μg/mL。

2.5 加樣回收率試驗

取樣品溶液進行測定，在顯色過程中按照樣品中甘氨酸的量，按5.0 μg/mL、7.5 μg/mL、10.0 μg/mL3 個濃度水平，精密加入適量甘氨酸對照品溶液，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

由表1 數據可知，3 個不同添加水平的回收率分別為99.1%、99.6%、100.5%，精密度在0.3%～1.5%之間，表明該方法測定結果穩定可靠。

3 結論

選取湖南湘西地區吉首市瀘溪縣、花垣縣、保靖縣、古丈縣、永順縣、龍山縣等7 區縣具有代表性的湘西臘肉樣品，采用茚三酮比色法測定臘肉中甘氨酸含量。通過對試驗前處理條件優化，得出最佳試驗條件為：溶液pH=6.0，顯色劑用量2.0 mL，水浴溫度和時間分別為100 ℃、15 min，乙醇用量5.0 mL，冷卻時間為10 min。在568 nm波長下測定樣品溶液的吸光度，甘氨酸測定的線性范圍在0.14 μg/mL～50 μg/mL 時，線性相關系數為0.999 4。加標回收率達99.1%～100.5%，檢出限為0.14 μg/mL，測量結果的相對偏差為0.3%～1.5%（n=6）。試驗結果表明，該方法具有操作簡單，成本低廉，重現性穩定等特點，可用于湘西臘肉中甘氨酸含量的測定。