包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢驗方法相關問題的探討

李 靜

（山西省食品質量安全監督檢驗研究院，山西太原 030012）

銅綠假單胞菌原名綠膿桿菌，是一種常見的條件致病菌，分類學上屬于細菌界變形菌門γ-變形菌綱、假單胞菌目、假單胞菌科、假單胞菌屬，革蘭氏陰性桿菌。菌體細長且長短不一，有時呈球桿狀或線狀，成對或短鏈狀排列。銅綠假單胞菌在自然界分布極為廣泛，是土壤中存在的最常見的細菌之一，水、空氣、人的皮膚、呼吸道和腸道等都有該菌存在。銅綠假單胞菌為專性需氧菌，生長溫度范圍25 ℃～42 ℃，該菌在4 ℃不生長而在42 ℃可以生長，易在潮濕的環境下存活，是區別于其他細菌的顯著特征之一。銅綠假單胞菌是條件致病菌，即在某種特定條件下才能致病，導致人體腸道疾病、皮膚炎癥和繼發化膿感染，急性腸道疾病和皮膚炎癥，可引發角膜炎、肺炎等下呼吸道、嬰兒腹瀉泌尿系統感染。銅綠假單胞菌耐藥性強，對抵抗力較差的人群危害更大，可引起繼發感染或混合感染的慢性炎癥，甚至引起諸如腦炎、敗血癥等嚴重急性感染。

目前，我國市場上生產銷售的包裝飲用水（除生活飲用水、飲用天然礦泉水外）應符合《食品安全國家標準 包裝飲用水》（GB 19298—2014）。標準中銅綠假單胞菌的限值規定為n=5，c=0，m=0（n 為同一批次產品應采集的樣品件數；c 為最大可允許超出m 值的樣品數；m 為微生物指標可接受水平限量值）。即一個批次包裝飲用水采集樣品數量為5 桶，任何一桶水中都不可檢出銅綠假單胞菌，否則就判定為銅綠假單胞菌項目不合格。

包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢驗采用《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）中進行測定，為保證測定結果準確，在實際操作過程中，應根據水樣污染情況選擇合適的稀釋梯度，并注意濾膜放置、菌落純化、綠膿菌素確認試驗等關鍵環節對試驗結果的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品來源于省內銷售的桶裝飲用水，共計293批。

1.2 試劑與培養基

假單胞菌瓊脂基礎培養基/CN 瓊脂、金氏B 培養基、乙酰胺液體培養基、綠膿菌素測定用培養基、鈉氏試劑、營養瓊脂、氧化酶試劑，北京陸橋技術股份有限公司；三氯甲烷、分析純，天津市化學試劑有限公司；鹽酸，分析純，北京化工廠；甘油，分析純，天津市天力化學試劑有限公司。

1.3 標準菌株

銅綠假單胞菌標準菌株（ATCC 27853）；熒光假單胞菌標準菌株（CICC 21620）。

1.4 儀器設備

SSM-6 多聯過濾器，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；0.45 μm 微孔濾膜，上海興亞凈化材料廠；BSC-1300IIA2 生物安全柜，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；BPC-500F 生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；EA-160IFE 紫外燈。

2 檢驗方法

采用GB 8538—2016 中濾膜法測定桶裝飲用水中銅綠假單胞菌，在100 級的潔凈工作臺進行過濾操作，使用孔徑0.45 μm 濾膜過濾250 mL 水樣或稀釋液，將濾膜移至CN 瓊脂培養基上，在培養箱中36 ℃培養48 h 后觀察CN 平板上菌落形態，并進一步驗證可疑菌落。

在CN 瓊脂平板上可能生長的菌落形態有：藍/綠色菌落、產熒光非藍綠色菌落、紅褐色菌落、其他顏色菌落。不同顏色形態菌落要進一步進行驗證（見表1）。CN 瓊脂平板上不同菌落形態，進行相應試驗驗證后確定可疑菌落是否為銅綠假單胞菌，確定后計數并得出結論。

表1 銅綠假單胞菌在CN 瓊脂平板上菌落形態的選擇與判定

3 結果

共計檢驗桶裝飲用水293 批次，其中檢出銅綠假單胞菌的有27 批次，檢出率為9.22%。檢測結果表明桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢出率相對較高。

4 討論

為保證包裝飲用水中銅綠假單胞菌不出現漏檢和假陰性結果，總結得出在檢驗過程中需要注意以下幾點，以降低漏檢和假陰性的可能性。

4.1 過濾水樣

考慮到水樣受污染程度未知且不一致，可以按照GB 4789.2 中樣品稀釋的要求，按照原液（必選）、1∶10、1∶100、1∶1000 的遞增稀釋比例，選擇2～3 個連續的稀釋度，然后再進行過濾，這樣如果水樣受污染程度嚴重，將樣品稀釋后過濾，保證濾膜上生長的菌落數量在適宜范圍內，從而更好地計數和挑取單個菌落做驗證試驗，計數時按照GB 4789.2 中7.1 的計算方法來進行。

4.2 濾膜的放置

放置濾膜時，應該與培養基表面緊密貼合住，不能產生空隙，因為產生空隙的地方會造成菌落缺乏營養而限制其生長，最終影響銅綠假單胞菌的生長，導致計數不夠準確。

4.3 純化可疑菌落

如果濾膜上生長的菌落過多影響計數，需進行多次分離純化（可使用CN 平板或營養瓊脂平板），直至出現多個單菌落以利于挑取單菌落進行驗證試驗。

4.4 綠膿菌素試驗

飲用天然礦泉水檢驗方法GB 8538 修訂后，微生物檢驗項目主要變化是銅綠假單胞菌的檢驗增加了綠膿菌素驗證試驗。要求CN 瓊脂平板上長出藍/綠色菌落不能直接判定為銅綠假單胞菌陽性（2008 版檢驗方法無此項要求），而是需要經過綠膿菌素試驗驗證才能最終判定為陽性。在進行綠膿菌素試驗時，必須挑取CN 平板上新鮮的（生長24 h～48 h）不同類型的單菌落各2～3 個進行培養，其次要注意用三氯甲烷浸泡溶解的時間問題，必須待三氯甲烷提取液由無色變為藍色后，方可將其移至另一試管中滴加1 moL/L 鹽酸，振蕩后靜置，最后判定結果。