ELISA與HPLC-MS檢測玉米中黃曲霉毒素B1的比較分析

陳 琛， 王炳彥， 鐘興文， 楊旭艷， 馬 丹， 戚 敏，孫照程， 陳 瑩， 孔凡虎， 華雪妃， 章雨竹， 陶琳麗*， 張 曦*

（1.云南農業大學動物科學技術學院，云南省動物營養與飼料重點實驗室，云南昆明 650201；2.云南省楚雄州牟定縣新橋鎮畜牧獸醫站，云南牟定 675501；3.大理白族自治州動物衛生監督所，云南大理 671000；4.云南省獸藥飼料監測所，云南昆明 650201）

黃曲霉毒素（AFT）是黃曲霉和寄生曲霉產生的次生代謝產物，是一組有著類似結構的化合物總稱。黃曲霉毒素B1（AFB1）是目前已知的致癌性最強的一種化學物質（Iarc，2010），主要作用的靶器官是肝臟，對人和動物都能造成極大的損傷。玉米作為能量飼料原料供給動物，間接被人類食用，由于玉米中黃曲霉毒素污染普遍，且以AFB1為主，成為人們最關注的農作物之一（高秀芬等，2011）。根據飼料衛生標準 （GB 13078-2017）， 玉米中AFB1限量要求不超過50 μg/kg，但據相關文獻報道，我國飼料原料霉菌毒素污染超標比例高達一半以上（程傳民等，2014）。因此加強對玉米中AFB1的監測是飼料安全監管部門每年的重點工作。

目前，國內外檢測霉菌毒素的方法主要有酶聯免疫吸附（ELISA）法（Oplatowska-Stachowlak等，2016）、薄層色譜（TLC）法（柳其芳，2006）、毛細管電泳（CE）法（王曉琳等，2015）、氣相色譜（GC）法與氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）法（馬曉宇和林英庭，2018）、高效液相色譜（HPLC）法（劉柱等，2014）與高效液相色譜-質譜聯用 （HPLCMS）法 （殷秋妙等，2018），其中，ELISA 法和HPLC-MS法是檢測飼料中AFB1最常用的方法。ELISA法是一種把酶的高效催化作用與抗原抗體的特異性免疫反應有機結合起來的檢測技術，其操作快速便捷、靈敏度高、安全性高、污染少、干擾小。HPLC-MS法可同時對多種毒素進行定性和定量檢測，易于控制，定量準確度高，適用于飼料中6種黃曲霉毒素的定性、定量檢測 （殷秋妙等，2018；王瑞國等，2015）。本實驗通過ELISA法和HPLC-MS法對玉米中AFB1含量進行測定比較，討論兩者之間的差異及相關性，為今后玉米中AFB1的檢測工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 玉米，從多家飼料企業送檢的玉米樣品中取樣30份，用四分法縮減取200 g，用粉碎機粉碎后過40目篩，混勻裝入自封袋中備用；甲醇、乙酸、甲酸、乙腈，均為色譜純；氯化鉀，氯化鈉、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉，吐溫-20、鹽酸、氫氧化鈉，均為分析純；蒸餾水和超純水；黃曲霉毒素B1標準品，純度≥97.0%，濃度為 20 μg/mL；玻璃纖維濾紙，直徑11 cm，孔徑1.5 μm；黃曲霉毒素B1/玉米赤霉烯酮/T-2毒素三合一免疫親和柱，北京華安麥科生物技術有限公司；ELISA試劑盒，北京龍科方舟生物工程有限公司。

黃曲霉毒素B1標準中間液：根據使用需要，準確吸取一定量的黃曲霉毒素B1標準溶液，用復溶液或玉米空白基質液稀釋，分別配成濃度為1000 ng/mL的中間液1和100 ng/mL的中間液2，現配現用。

黃曲霉毒素B1標準工作液：分別吸取一定量的中間液2，用復溶液或玉米空白基質液稀釋，分別配出兩組濃度為 0.5、10、25、50 ng/mL 的標準工作液，現配現用。

1.2 儀器與設備 AL104電子天平（METTLER TOLEDO）；300 g搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；SHA-B恒溫振蕩器（常州智博瑞儀器制造有限公司）；GENIUS 3渦旋混勻器（IKA@VORTEX）；H2050R 高速冷凍離心機（Xiangyi Centrifuge Instrumen Co.,Ltd）；N-EVAP111氮吹儀 （Organomation Associates,Jnc）；SPE-12A 12孔固相萃取裝置 （上海啟前電子科技）；TSQ QUANTIVA高效液相色譜—串聯質譜儀（Thermo Scientific）；KHB ST-360酶標儀（上海科華實驗系統有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶聯免疫法 ELISA法是一種把酶的高效催化作用與抗原抗體的特異性免疫反應有機結合起來的檢測技術。在本實驗中，ELISA法是按照GB/T 17480-2008《飼料中黃曲霉毒素B1的測定酶聯免疫吸附法》來檢測，其基本原理是利用抗原和抗體先結合到某固相載體表面，將標準溶液或待測樣品（含待測抗原和抗體）和酶標抗原或抗體按一定程序與結合在固相載體表面的抗原或抗體反應，形成免疫復合物，反應終止時，免疫復合物與待測物中抗原或抗體的量成一定比例關系，經洗滌反應液之后，再加入酶反應底物，底物即被固相載體上的酶催化為有色產物，最后用目測法或儀器法通過與AFB1標準溶液比較判斷或計算試樣中AFB1的含量（肖樺等，2006）。結合本實驗所選用的AFB1定量檢測試劑盒，檢測同樣基于抗原抗體反應，酶標板微孔條上預包被AFB1抗體，加入校準品/樣品，AFB1-HRP（黃曲霉毒素B1酶標記物）后，校準品/樣品中殘留的AFB1同AFB1-HRP競爭微空條上預包被抗體的抗原結合位點，因此結合在微孔條上的AFB1-HRP量與校準品/樣品中殘留AFB1的濃度呈負相關，經TMB底物顯色，樣品吸光值與其殘留的AFB1的含量呈負相關，與標準曲線比較即可得出樣品中AFB1的含量。

前處理：稱取（5±0.1）g粉碎后過篩的玉米樣品于離心管中，加入25 mL 70%甲醇溶液，充分振蕩提取3 min，靜置后取上清液4000 r/min離心5 min，向500 μL樣品稀釋液中加入離心后的上清液500 μL，取混勻液用試劑盒進行檢測。

檢測參數設置：樣品經酶聯免疫試劑盒反應后，立即用酶標儀定量，即在450/630 nm雙波長下讀取吸光度值。

1.3.2 高效液相色譜—質譜聯用法 HPLC-MS法是按照NY/T 2071-2011《飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的測定 液相色譜--串聯質譜法》進行測定，采用色譜保留時間和質譜碎片及其離子豐度比定性，外標法定量。但在質譜檢測中，必然存在干擾待測物質離子化的物質，也就是除了待測物本身其他存在的物質都可能間接或直接引起待測物響應，引發待測信號抑制或增強的現象，由此產生基質效應。引發基質效應的物質包含生物樣品中的內源性成分和樣品前處理過程中引入的外源性成分，意味著樣品本身、樣品基質、樣品前處理過程，色譜條件和不同離子化模式都可能對檢測結果產生影響，這些影響是個十分復雜的過程（Matuszewski等，2003）。因此本實驗設計兩組用于外標定量的標準曲線，一組選用和待測樣品同源的玉米做空白基質加標，過程相對復雜，成本較高；另一組直接采用復溶液加標為純標，相對簡單省時，成本較低；樣品按照農業農村部標準和免疫親和柱操作步驟進行前處理，分別使用兩條標準曲線外標計算結果，與酶聯免疫法測出的結果相比較，討論幾者之間的差異及相關性，為今后玉米中AFB1的檢測工作提供參考。

前處理：稱取（5±0.1）g粉碎后過篩的玉米樣品于離心管中，加入25 mL提取液（80%乙腈-水溶液）提取，在恒溫振蕩器（200～300 r/min）上劇烈振蕩20 min，用高速離心機（400 r/min）離心5 min，取5 mL離心后的上清液加入35 mL稀釋液稀釋，混勻，用玻璃纖維濾紙過濾至澄清，取20 mL濾液過柱。取出接近室溫的免疫親和柱，完成親和柱與固相萃取裝置的連接，在親和柱上方連接裝有20 mL濾液的注射器針筒，調節固相萃取開關，使濾液以1～2滴/s的速度流出，待液體排干后，先用10 mL洗滌液洗滌一次，再用10 mL超純水洗滌一次，流速為2～3滴/s；待液體排干后，調節裝置開關關閉，在親和柱內加入2 mL洗脫液，靜置3 min，然后以1滴/s速度洗脫，收集洗脫液，在50℃的氮氣下吹干洗脫液，用1 mL甲酸乙腈溶液復溶，過0.22 μm有機濾膜，裝瓶上機。

檢測參數設置：色譜柱：C18柱（長度50 mm，內徑 1.9 μm）；流動相：0.1%的甲酸溶液和 1∶1 的甲醇乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；柱溫：33 ℃；進樣量：5 μL；質譜檢測器。

1.4 統計與分析

1.4.1 ELISA法數據處理 所有數據采用Microsoft Excel軟件進行整理，根據公式計算樣品的百分吸光率，以校準品的百分吸光率為縱坐標，以AFB1校準品含量（μg/kg）的對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣品的百分吸光率帶入標準曲線，從標準曲線上讀出所對應的樣品含量。根據選用的試劑盒說明書，結果判定為：若檢測結果小于2 ppb應報告為小于2 ppb，若結果大于2 ppb小于50 ppb則報告實際定量結果，若檢測結果大于50 ppb即報告大于50 ppb。

式中：B為校準品或樣品的平均吸光度值；B0為0 μg/mL標準溶液的平均吸光度值。

1.4.2 HPLC-MS法數據處理 所有數據采用Microsoft Excel軟件進行整理，基質加標組標準曲線用玉米基質液 （空白玉米經前處理復溶所得）稀釋AFB1標準品配制上機標準點，以上機標準點濃度為橫坐標，上機測出的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，根據樣品上機后的相對離子豐度比是否在最大允許偏差范圍內，定性判定樣品中是否存在AFB1，如不存在，則判定為未檢出，如存在，則將該峰的峰面積帶入標準曲線計算得出樣品上機濃度（ng/mL），根據前處理的稀釋過程，計算玉米中AFB1的含量；純標組標準曲線用復溶液直接稀釋AFB1標準品配制上機標準點，其余處理同基質加標組。樣品中黃曲霉毒素B1的含量（Xi）以質量分數表示（μg/kg），用下列公式計算：

式中：Ci為樣品上機濃度，ng/mL；V1為提取液體積，mL；V2為待稀釋濾液加稀釋液之后的體積，mL；V3為復溶體積，mL；V4為待稀釋的濾液體積，mL；V5為待上樣檢測的濾液體積，mL；m 為樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 HPLC-MS兩組標準曲線的結果 如圖1所示，當AFB1上機濃度為30.89 ng/mL，即樣品含量為61.78 μg/kg時，兩條曲線峰面積相等。當AFB1上機濃度＜30.89 ng/mL， 即樣品含量＜61.78 μg/kg時，在同一上機濃度下，純標組的峰面積＞基質加標組的峰面積；當上機濃度＞30.89 ng/mL，即樣品含量＞61.78 μg/kg時，純標組的峰面積＜基質加標組的峰面積。

圖1 玉米黃曲霉毒素B1標準曲線

2.2 玉米中黃曲霉毒素B1含量的測定結果 由表1可以看出，使用ELISA和HPLC-MS檢測同一份樣品，1～12號樣品的AFB1含量均低于酶聯檢出限（＜2 μg/kg），使用 HPLC-MS 同樣未檢出（＜1 μg/kg）。 13 號玉米使用 HPLC-MS 未檢出 AFB1，ELISA檢出含量為2.2 μg/kg，十分接近酶聯檢出限（2 μg/kg）。而14～17號玉米檢測結果具有相同特征，用ELISA檢測都低于酶聯檢出限（＜2 μg/kg），14、16、17號玉米用HPLC-MS檢測，在純標組曲線上得到的結果均低于液質聯用檢出限（＜1 μg/kg），但都能出峰，且樣品中AFB1保留時間與標準溶液保留時間的偏差不超過標準溶液保留時間的2.5%，定性離子豐度比與濃度接近的標準溶液中對應的定性離子豐度比偏差亦在允許范圍內，可定性判斷出峰物質為AFB1，但兩組曲線下的HPLC-MS檢測結果又具有差異，在純標組標準曲線上得到的結果基本小于2 μg/kg，與酶聯檢出結果十分符合，而在基質液加標組標準曲線上得到的結果為4.87～5.72 μg/kg，高于酶聯檢測結果的4～13倍。18、19號玉米用ELISA檢出的結果高于酶聯檢出限1 μg/kg左右，但兩組曲線下的HPLCMS檢測結果特征與14～17號玉米結果類似。20～25號玉米的檢測結果雖有差異，但總體特征相符，具體表現為用ELISA檢測出的AFB1含量與HPLC-MS（純標組）檢測結果的偏差很小，平均偏差 為 0.93 μg/kg， 最 小 偏 差 為 0.42 μg/kg； 用HPLC-MS（玉米基質液加標組）檢出的AFB1含量平均高于用ELISA或HPLC-MS（純標組）檢出結果的2.2倍。26號和27號玉米在兩種HPLC-MS檢測曲線下的結果比較接近，偏差為1～3 μg/kg，高于用ELISA檢出結果的2～2.5倍。28～30號玉米樣品不論使用ELISA還是HPLC-MS檢出的結果都高于曲線范圍，且都超過飼料衛生標準中AFB1的限量要求，均為AFB1超標樣品。

表1玉米中AFB1檢測結果對比表 μg/kg

總體來說，30份樣品用ELISA檢測或HPLC-MS檢測都能判定玉米中AFB1含量是否超標，且判定結果一致，但具體檢出量存在差異。樣品中AFB1含量低于ELISA檢出限的，基本也低于HPLC-MS檢出限；低于HPLC-MS檢出限但能出峰，且峰定性判定為AFB1的，AFB1測定結果ELISA≈HPLC-MS（純標組）。當樣品中AFB1含量為2～6 μg/kg時，測定結果 HPLCMS（純標組）＜ELISA＜HPLC-MS（玉米基質液加標組），且HPLC-MS（玉米基質液加標組）測定值約為ELISA和HPLC-MS（純標組）的2～13倍；當樣品中 AFB1含量＞11 μg/kg時，測定結果ELISA＜HPLC-MS（純標組）≈HPLC-MS（玉米基質液加標組）。當樣品中AFB1含量用ELISA檢測高于限量要求的，用HPLC-MS檢測也同樣超出限量要求，且HPLC-MS（純標組）的測定結果均最大。

3 討論

本實驗中30份玉米樣品，用ELISA檢測AFB1的檢出率為 40%，HPLC-MS的檢出率為57%，兩種方法檢測AFB1超標率均為10%，相較謝文梅等（2017）測得2017年1～6月全國各地玉米AFB1檢出率88.89%，此次檢測的玉米樣品受AFB1污染較輕，只有個別玉米含量超標，與黃俊恒和黃廣明 （2018）2017年檢出華中地區玉米樣品AFB1超標率10.5%相吻合，說明近年來玉米相較其他谷物受黃曲霉毒素B1污染趨勢有所下降，但仍然屬于易被污染范疇（謝文梅等，2017）。當AFB1測定結果在限量要求內時（＜50 μg/kg），用 ELISA檢測的結果均小于HPLC-MS（玉米基質液加標組）測定結果，HPLC-MS（純標組）測定結果也均小于HPLC-MS（玉米基質液加標組）測定結果；當HPLC-MS測定值在AFB1限量要求范圍內時（＜50 μg/kg），在同一上機濃度下，基質加標組的峰面積均小于純標組的峰面積，因此基質的存在可能導致離子減弱效應，引起較低的響應信號，表現為峰面積較小 （徐炎炎等，2017）。所以在本實驗中，當玉米中AFB1含量未超過61.78 μg/kg時，可對比得出玉米基質對AFB1出峰面積的影響為基質減弱效應，但在基質加標曲線上外標定量得出的樣品含量平均高于純標曲線的3.6 μg/kg左右，這可能由于基質玉米本底含有少量的待測物所致；反之，當玉米中AFB1含量超過61.78 μg/kg時，則表現為基質增強效應。

在本實驗中，玉米AFB1含量在限量范圍內時，ELISA陽性判定結果與HPLC-MS（純標組）基本一致，假陽性為0，因此即當檢測樣品數量眾多，涉及范圍或地域廣時，可用ELISA進行初篩，節約時間和成本，再用HPLC-MS對陽性樣品和超標樣品進行復檢，或者用HPLC-MS對不同樣品含量分布范圍內的樣品進行抽檢，驗證ELISA測定結果；但ELISA作為一種快速篩選手段，行標或者國標很少，因此給判定結果帶來不確定性，往往在檢測過程中易出現假陽性，若要降低假陽性，除了可適當增大稀釋倍數以外，使用其他檢測手段復檢也必不可少（賈衛昌和朱寅，2015；何方洋等，2015）。使用HPLC-MS法定性定量檢測玉米AFB1更加準確，把色譜的高分離度、高靈敏性和質譜檢測器的高選擇性、高靈敏性相結合（張明等，2018），可對ELISA檢測結果進行驗證和復檢。當ELISA測定結果＜2 μg/kg時，HPLC-MS可選用純標曲線進行驗證；當 ELISA測定結果為 2～6 μg/kg時，HPLC-MS選用純標曲線得出的結果十分接近ELISA，選用基質液加標曲線得出的結果是前兩者的2～13倍；當ELISA測定結果＞11 μg/kg時，HPLC-MS選用純標曲線或基質液加標曲線都可以，兩者都是ELISA測定結果的1～2倍。在樣品中AFB1含量＜61.78 μg/kg時，若考慮待測樣品量多，節約成本，縮短前處理時間等因素，運用HPLC-MS法可實際選用配制純標曲線，定量得出的結果加上3.6 μg/kg即可大致相關為基質加標曲線得出的樣品含量。

目前，ELISA法和HPLC-MS法都是檢測樣品中AFB1含量的常用方法。ELISA法基于抗原抗體特異性反應，操作簡便快速，特異性強，與HPLCMS法相比，簡化了樣品前處理和上機過程，非常適用于玉米樣品中黃曲霉毒素B1的大量初篩。HPLC-MS法采用免疫親和柱純化，同樣基于抗原抗體的特異性結合，雖檢測靈敏度高，準確性好，但前處理較為復雜，檢測時間較長，經濟成本較高，親和柱有可能出現洗脫不完全的情況，且黃曲霉毒素質量極輕，復溶后使用氮氣吹干時容易把毒素吹飛，操作者對氮氣吹干程度的把控也存在差異，因此HPLC-MS法適用于對ELISA的驗證和復檢。

4 結論

本研究利用酶聯免疫（ELISA）法和高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）法測定玉米樣品中AFB1含量，得到兩種方法在檢測玉米中AFB1含量為0～50 μg/kg和大于 50 μg/kg之間的相關性，ELISA對AFB1的檢出判定和HPLC-MS基本一致。當配制HPLC-MS標準曲線時，可根據情況選用純標曲線或基質液加標曲線外標定量。在實際工作中，如果掌握了兩種方法之間的差異性和相關性，就可互補兩者之間的檢測判定，提升檢測效率和準確率，同時為準確定量玉米中黃曲霉毒素B1含量提供數據參考。