適用于制備對蝦發酵飼料的益生芽孢桿菌復配組合的篩選和評價

王競儒， 王 洋*， 余政豪， 喬秀亭， 程鎮燕，崔 培， 王慶奎， 孫金輝，曹 鵬，白東清

（1.天津農學院水產系，天津西青 300384；2.天津市寶坻區漁翁水產科技發展有限公司，天津寶坻 301800）

益生菌是指一類可以直接飼喂動物的有益活體或死的微生物。在水產動物養殖過程中，益生菌可作為水產動物飼料添加劑，或用于制備發酵飼料。目前，在水產養殖中應用較廣的水產益生菌主要包括芽孢桿菌屬 （Bacillus）、酵母菌（Saccharomyces）和光合細菌（Photorophic bacterium）。 益生菌在對蝦養殖中的應用非常廣泛 （朱金星等，2017），最主要的應用方式為直接添加到飼料中（Azadis等，2005）。然而，蝦類的消化道較短，飼料在體內停留時間約2 h（李健等，1993）。因此，如果采用拌料投喂的方式添加益生菌，無法充分發揮其降解飼料大分子物質，提高消化吸收率的作用。研究表明，直接投喂芽孢桿菌僅能使斑節對蝦的飼料干物質、蛋白質、脂肪水解率增加不到2%（於葉兵等，2007）。相比之下，復合益生菌發酵后的飼料中大分子物質轉化成小分子，如氨基酸等，可提升飼料的可消化性（胡紅偉等，2017）。同時益生菌發酵可以降低飼料原料中的抗營養因子，提高對蝦腸道消化酶活性，還能產生抑菌物質，提高水產動物抗病性（吳東，2015）。

研究證明，多株益生菌混合發酵效果優于單一菌株（陳樹河等，2016）。因此本研究擬篩選適用于制備對蝦發酵飼料的益生芽孢桿菌復配組合，并對組合菌株的產酶活性進行評價，以初步優化發酵對蝦飼料的條件。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 益生芽孢桿菌菌株7株，保存于天津農學院水產學院，使用前以LB液體培養基活化至活菌數 1×109～ 3×109cfu/mL。

1.2 試驗試劑 磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、三氯乙酸、無水碳酸鈉、L-酪氨酸、鹽酸、三水乙酸鈉、冰乙酸、羧甲基纖維素鈉、3，5-二硝基水楊酸、四水酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、無水葡萄糖、檸檬酸、蒸餾水、檸檬酸鈉、麥芽糖、酒石酸鉀鈉、干酪素等，均為國產分析純。

1.3 主要試驗儀器 W-CJ-2FO潔凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；SMLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：日本Sanyo公司；FA2104電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；UV-5500紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；SHP-250型微生物生化培養箱：上海三發科學儀器有限公司；YZB-GER 1841-2014高速冷凍離心機：奧默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.4 LB培養基 按照張士偉等（2013）的方法制備LB種子培養基（固體培養基需加入細菌瓊脂粉1.5% ～2.0%），pH 7.0，121℃滅菌20 min后使用。

1.5 益生芽孢桿菌復配組合的篩選 根據表1，各菌株按照OD600值1∶1∶1比例組合，接種于LB培養基，37℃培養12 h后測定上清液酶活性。

表1 菌株組合情況表

蛋白酶活性的定量測定采用福林酚法 （中國國家標準委員會，2009），淀粉酶活性的定量測定采用3，5-二硝基水楊酸法 （張龍翔等，1982），纖維素酶活性的定量測定采用DNS法 （楊海峰等，2014）。使用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。以三種酶活性的綜合響應值作為評價指標，選取最優組合。計算公式為：

響應值=蛋白酶活性×50%+（淀粉酶活性+纖維素酶活性）×25%。

1.6 優良芽孢桿菌復配組合發酵飼料 采用單因素優化法，使用自封袋模擬發酵容器，分別控制加水量（0.8、1.0、1.3、1.5 mL/g 飼料）、接種量（0.1%、0.5%、1%、5%），置于 37℃恒溫箱發酵 24 h，對比飼料顆粒黏合狀態，以確定發酵飼料的最適注水量；采用平板法進行活菌計數，以確定最適接種量；在最佳注水量和接種量條件下，分別發酵對蝦開口餌料（南美白對蝦配合飼料-開口料，唐山三發普林飼料有限公司）和對蝦成蝦飼料（通威南美白對蝦配合飼料-成蝦料，通威股份有限公司），發酵24 h后進行活菌計數，以確定適用的飼料種類；選用適宜飼料種類，向自封袋內注入無菌空氣（10、20、30、40、50 mL/g 飼料）、適宜水量和接種量，發酵24 h后進行活菌計數以確定最適通氣量。

2 結果與分析

2.1 組合菌酶活性定量測定和響應值結果 表2可知，在所測的9組芽孢桿菌組合菌中，組合8-Z所產蛋白酶活性明顯高于其他組合，達到（28.58±0.34）U/mL。復配菌株應用于對蝦飼料或者制備發酵飼料過程中，產生的消化酶可以與水產動物內源酶相互補充，從而提高消化率（陽艷林等，2017；仉明軍等，2013）。許多研究發現，為水產動物補充外源性消化酶，能夠提高水產動物的飼料利用率。張娟娟等（2012）試驗證明，在虹鱒魚的低魚粉飼料中添加蛋白酶，可提高其胃腸蛋白酶活性，進而改善生長性能。與其他報道相比，本研究中所測得的各菌株蛋白酶活性并不高，這可能與培養時間短（陳營等，2004）以及培養基成分的差異有關。因此，本試驗各菌株在LB培養基中僅培養12 h后測得的酶活性，并不能完全代表菌株在發酵飼料或者宿主腸道內的產酶能力。

組合3-Z所產的淀粉酶活性較其他復配組合高，達到（5.8±0.34）U/mL。 其淀粉酶活性顯著高于其他報道，如經紫外誘變育種得到的高產淀粉酶菌株，淀粉酶活性只達到2.264 U/mL（馬穎輝等，2011）；游龍等（2018）測定的野生型芽孢桿菌，胞外淀粉酶活性最高為3.0 U/mL。表明本試驗所篩選的芽孢桿菌產淀粉酶活性較高，更具研究和實際應用價值。有試驗證明，芽孢桿菌的淀粉酶活性會隨溫度變化而發生改變，在0～40℃其淀粉酶活性隨溫度升高而上升，之后隨溫度升高而下降（高永生等，2011）。

表2 組合菌株蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶酶活性定量和響應值結果

菌株組合3-Z所產纖維素酶活性最高，達到（34.53±7.41）U/mL。 此結果高于屈二軍等（2008）經過紫外誘變得到的高酶活枯草芽孢桿菌以及江國忠 （2010）所篩選的野生型高酶活枯草芽孢桿菌。在飼料中添加纖維素酶，可改善養殖動物對粗纖維的利用率（張新武等，2002）。纖維素酶可以刺激內源酶分泌，還可以與其他內源酶共同作用，從而促進動物的消化和吸收（王仁華等，2011）。

2.2 優選芽孢桿菌形態 7株菌均為革蘭氏陽性桿菌，大小和長短有菌株特異性，無特殊排列方式。

2.3 16S rDNA測序結果 測定上述優選菌株的16S rDNA序列，通過與數據庫其他菌株的序列信息進行比對，得出鑒定結論：菌株8-D、4-D、9-D、3-D、7-D、5-D均為枯草芽孢桿菌；菌株2-D為地衣芽孢桿菌；菌株6-D為地衣形芽孢桿菌；菌株1-D為解淀粉芽孢桿菌。使用MEGA3.1軟件構建系統發育樹，圖1為菌株2-D的系統發育樹。

2.4 飼料發酵條件優化

2.4.1 不同加水量發酵飼料形態觀察 通過觀察，加入0.8 mL蒸餾水的飼料（1 g）經過24 h發酵后，飼料顆粒呈現較干燥狀態，故不能充分發酵；而加水量1.3 mL和1.5 mL的兩組則呈現較為潮濕、易碎狀態，會影響發酵后配合飼料在水中的穩定性；加水量1.0 mL的飼料發酵24 h后呈現較為理想的狀態。

圖1 菌株2-D系統發育樹

2.4.2 不同接種量發酵飼料的活菌數 由表3可知，接種芽孢桿菌組合8-Z的接種量為5%的飼料（成蝦飼料和開口料）在發酵24 h后，所得的活菌數最高，其中成蝦飼料活菌數為9.47×108cfu/g，開口料活菌數為4.33×108cfu/g。其次為接種量0.50%的飼料（成蝦飼料和開口料），其中成蝦飼料的活菌計數結果為4.23×108cfu/g，開口料的活菌計數結果為3.67×108cfu/g。出于對飼料成本和活菌數的綜合考慮，選擇接種量為0.50%作為芽孢桿菌組合菌8-Z的最適接種量。

表3 不同接種量發酵24 h后蝦開口餌料和成蝦飼料活菌數cfu/g

2.4.3 不同通氣量發酵飼料的活菌數 如表4所示，通入空氣量為20 mL的飼料發酵后活菌數最高，為 6.48×108cfu/g。

表4 不同通氣量發酵24 h后成蝦飼料的活菌數cfu/g

3 結論

適用于制備對蝦發酵飼料的益生芽孢桿菌組合為8-Z（包含解淀粉芽孢桿菌1-D，枯草芽孢桿菌3-D和枯草芽孢桿菌9-D）。制備對蝦發酵飼料的適宜參數為：加水量1 mL/g，接種量0.50%（0.5×107～ 1.5×107cfu/g），充氣量 20 mL/g，發酵24 h成蝦飼料的活菌數為6.48×108cfu/g。