HPLC方法同步測定四黃止痢復方中黃芩苷和小檗堿的含量

王 培， 鐘文詩， 孫嘉一， 徐子恒， 蔣 紅，王宏軍

（錦州醫科大學畜牧獸醫學院，遼寧錦州 121001）

四黃止痢組方源自《中國獸藥典》（2015版），由黃芩 （Scutellaria baicalensis Georgi）、 黃柏（Phellodendron chinense Schneid）、 黃 連 （Coptis chinensis Franch）、大 黃 （Rheum offcinale Baill）、甘草 （Glycyrrhiza uralensis Fisch）、板藍根（Isatis tinctoria L）六味中草藥組成，能有效治療雞、豬的濕熱瀉痢，雞大腸桿菌病等，具有清熱瀉火、解毒止痢等功效。熊玥等（2015）在四黃止痢顆粒制劑的質量標準研究中僅涉及到黃芩苷的高效液相色譜（HPLC）含量檢測，未見對其他成分的HPLC檢測；賈紀萍等（2017）用薄層色譜定性鑒別了四黃止痢顆粒制劑中的鹽酸小檗堿和黃芩苷，未進行定量分析。鑒于此，本實驗以甲醇為提取溶劑，旨在建立HPLC同步測定四黃止痢復方中黃芩苷與小檗堿的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 高效液相色譜儀 （L-7420），日本日立公司，配四聯泵、脫氣泵、紫外檢測器和柱溫箱；色譜柱，島津InertSustian C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）， 天津市尚亞科技發展有限公司；旋轉蒸發儀（RE-5203），上海亞榮生化儀器廠；超聲波清洗器（KQ-300B），昆山市超聲儀器有限公司。甲醇（分析純），天津市風船化學試劑科技有限公司；甲醇（色譜純），天津市津東天正精細化學試劑廠；磷酸（分析純），天津南開大學精細化工股份有限公司。黃連、黃芩、黃柏、大黃、板藍根、甘草購自遼西國藥店。鹽酸小檗堿、黃芩苷對照品購自成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 色譜條件 流動相：甲醇-0.1%磷酸水梯度洗脫，有機相洗脫梯度為：0～5 min，20%～30%甲醇；5～10 min，30% ～40%甲醇；10～20 min，40% ～55%甲醇；20～30 min，55% ～60%甲醇；30～40 min，60% ～70%甲醇；40～ 50 min，70%～20%甲醇，流速1.0 mL/min；柱溫25℃；檢測波長為 278 nm；進樣量 10 μL。

1.3 樣品處理 將黃連、黃柏、黃芩、板藍根、大黃、甘草6味中草藥按照《中國獸藥典》收載處方配比粉碎，稱取復方中草藥粉末5.0 g。按1∶80料液比加入60%甲醇，超聲處理30 min后，離心取上清，旋轉蒸發濃縮至干。用1 mL甲醇溶解，即為待測樣品。

1.4 實驗方法

1.4.1 標準曲線繪制 將黃芩苷、鹽酸小檗堿用甲醇稀釋成0.01～0.12 mg/L的系列工作標準液，進行液相色譜分析。每個濃度點重復測定3次，取平均值繪制色譜峰面積-濃度標準曲線。

1.4.2 加樣回收率 稱取6份已測定的黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的復方中草藥提取物樣品0.1 g，按1.3方法制備供試溶液，加入適量混合標準液，在1.2色譜條件下檢測，重復6次，分析樣品回收率。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇 在國標基礎上以甲醇與0.1%磷酸水溶液為流動相，調整不同時間段流動相梯度，以黃芩苷、小檗堿能夠完全分離為主要指標，且其他峰分離能夠滿足要求，獲得了適宜的流動相洗脫梯度。

2.2 檢測波長的選擇 黃傳俊等（2018）用HPLC法測定金蟬止癢膠囊中鹽酸小檗堿和黃芩苷的研究中，檢測波長分別使用了265 nm和280 nm，在本實驗中，檢測波長為278 nm可同時檢測到黃芩苷和鹽酸小檗堿。

2.3 色譜分離 由圖1可知，在優化的色譜分離條件下，黃芩苷和鹽酸小檗堿獲得了良好的分離，鹽酸小檗堿和黃芩苷兩種化合物的保留時間分別為 23.998 min和 28.998 min。

2.4 標準曲線 將對照品系列濃度分別進樣檢測，以色譜峰面積（S）和對照品濃度（C，mg/L）作線性回歸。在濃度為0.01～0.12 mg/L時，黃芩苷的標準曲線為 S=2×107C+972477，R2=0.9964；鹽酸小檗堿的標準曲線為S=1×108C+231802，R2=0.9973。

2.5 加樣回收率 由表1可知，鹽酸小檗堿的平均回收率為98.058%，RSD值為0.914%；黃芩苷的平均回收率為98.400%，RSD值為0.896%。

2.6 精密度與重現性實驗 在12 h內不同時間段測定樣品中鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量，每個時間段重復進樣5次，6個時間段中鹽酸小檗堿的平均含量為（4.68±0.06）mg/g，RSD 為 1.39%；黃芩苷的平均含量為（9.29±0.35）mg/g，RSD 為 3.74%。 結果表明本方法具有很好的精密度和重現性。

圖1 樣品和對照品HPLC色譜圖

表1 加樣回收率

3 結論

在甲醇-0.1%磷酸水為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為278 nm條件下，可以同步檢測到四黃止痢復方中草藥提取物中黃芩苷、鹽酸小檗堿，并且該方法基線穩定，重復性理想，相對標準偏差＜1%，線性關系良好，兩種組分分離理想，回收率高，均在98%以上，能夠滿足檢測需求。所以本方法適宜同步測定四黃止痢復方中草藥提取物中的黃芩苷、鹽酸小檗堿含量。