正交法優化ZnO/MMT抗菌材料制備條件及抑菌活性研究

2019-06-18 08:02:50麻曉霞高靈娟馬玉龍翟喜會楊青萍馬春香

人工晶體學報 2019年5期

麻曉霞，高靈娟，馬玉龍，翟喜會，楊青萍，馬春香

(寧夏大學化學化工學院，省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點實驗室，銀川 750021)

1 引言

微生物細菌污染對飼料、食品、牲畜和人類健康造成了危害，尤其是存在于食品、飼料中的病原菌，如沙門氏菌(Salmonella)，大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)等已成為畜禽養殖業發展及公共衛生安全的重點監測對象[1]。許多動物會被感染且垂直傳播，并伴有交叉污染情況[2]；而大量使用抗生素會使其產生耐藥性，也給耐藥病原菌防治帶來新的問題。近年來，抗菌材料以其應用范圍廣、安全性高、有效期長等優點，可以有效降低細菌的交叉傳染[3]。

基于納米氧化鋅良好的抗菌活性[4]，若將氧化鋅負載于具有特殊功能的載體上不僅可以保持抗菌劑固有的特性、增強其穩定性，還有利于回收和重復使用，降低成本，增加其抗微生物功效的持續時間。常見抗菌材料的載體主要有沸石類、蒙脫石類、硅膠類以及磷酸鹽類等[5]。蒙脫石(montmorillonite，MMT)是一種硅鋁酸鹽礦物，有良好的離子交換性、吸附性和膨脹性[6]，在動物飼糧中適量添加MMT，能維護家禽腸道屏障功能，改善腸道健康，加快禽畜生長[7]。筆者通過正交試驗制備蒙脫石負載氧化鋅抗菌材料，探究ZnO/MMT抗菌材料制備條件的影響因素，并對所選菌種進行抑菌實驗，為動物疾病預防和治療提供參考。

2 實驗

2.1 材料

粗鈣基蒙脫石(97%)，購于內蒙古赤峰市和明生化工有限公司；鋅試劑、氯化鋅和氫氧化鈉等化學試劑均為分析純，購于天津市凱通化學試劑有限公司；沙門氏菌(ATCC 14028)、大腸桿菌(ATCC 25922)和金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)均購于國家微生物保藏中心。

2.2 實驗設計

選用反應物物料配比(1∶1，1∶2，1∶4，1∶8)、反應溫度(70 ℃，80 ℃，90 ℃，100 ℃)和反應時間為(18 h，24 h，30 h，36 h)為抗菌材料制備條件。以反應物物料配比(因素A)、反應溫度(因素B)、反應時間(因素C)為考察因素，每個因素以最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)為實驗研究指標，采用L16(45)設計正交表，ZnO/MMT抗菌材料制備因素水平如表1所示。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels in the orthogonal experiment designs

2.3 ZnO/MMT抗菌材料的制備

取粗品鈣基蒙脫石，加去離子水，攪拌1 h，靜置3 h，棄上清液和底部雜質，重復上述操作3～5次，收集懸浮液，離心分離，所得固體于70 ℃下干燥，研磨粉碎后過300目標準篩，即得蒙脫石純品(MMT)。

取一定量氯化鋅和氫氧化鈉溶于去離子水中，水浴恒溫振蕩，加入蒙脫石純品，攪拌后離心分離，去離子水洗滌3次，過夜干燥，125 ℃煅燒2 h，粉碎后過300目標準篩，即得載氧化鋅蒙脫石抗菌材料(ZnO/MMT)。

2.4 抗菌材料的表征

使用X射線衍射儀(XRD，Bruker D8)獲得材料晶體結構性質，X射線源為Cu Kα輻射。利用N2物理吸附儀(BET，JW-BK132F)測定樣品的孔結構特征。采用掃描電子顯微鏡(SEM，JSM-7500F)觀察樣品改性前后結構形貌變化及團聚情況。

2.5 抗菌材料MIC及MBC的測定

取不同濃度梯度的抗菌材料及提純MMT于試管中，加適量稀釋后菌種、液體培養基，混勻，置于培養箱中培養數小時，將未見細菌生長濃度記為材料的最小抑菌濃度(MIC)。從未見細菌生長的試管中取少量上層溶液至已凝固的固體培養基中，在恒溫培養箱中培養。固體培養基上未見細菌生長或者菌落數小于5的濃度記為材料的最小殺菌濃度(MBC)。

2.6 抑菌圈法對抗菌材料抑菌性能的測定

移取100 μL二代菌懸液于無菌固體培養基中，涂布均勻，放入直徑為1 cm的無菌壓片，37 ℃倒置培養24 h，用直尺測量抑菌環直徑(不包括壓片)。以MMT為陰性對照進行空白試驗。

3 結果與討論

3.1 極差分析法

以沙門氏菌為試驗菌種，MIC和MBC為測試指標，極差分析[8]該抗菌材料的抑菌性能。由表2可知，物料配比、反應溫度、反應時間對MIC的影響程度依次為RB>RA>RC。同理，運用極差分析法計算了MBC對應的RA、RB、RC依次為0.512、1.024、0.448，顯著性與MIC一致。

表2 抗菌材料對沙門氏菌的MIC和MBC實驗結果Table 2 MIC and MBC of antibacterial materials against Salmonella

3.2 方差分析法

方差分析法是一種利用實驗數據確定因素影響顯著性差異的統計分析技術[9]。以MIC研究指標進行方差分析(如表3所示)。物料配比、反應溫度、反應時間對抗菌材料MIC影響的顯著性依次為B>A>C，方差分析結論與極差分析結果一致。以MIC為研究指標，根據最優水平組合的優選原則[10]確定最優制備條件為實驗組合A4B1C1，即氯化鋅與氫氧化鈉比為1∶8，反應溫度為70 ℃，反應時間為18 h。采用鋅試劑分光光度法檢測了最優條件下所制備ZnO/MMT的中Zn的負載量為6.14wt%。

表3 MIC方差分析結果Table 3 MIC analysis of variance results

3.3 材料測試分析

圖1為MMT和不同溫度下ZnO-MMT復合抗菌材料的XRD圖譜。由圖1可知，MMT的對應晶面(001)在衍射角為5.9°時，其晶面間距為1.49 nm，屬鈣型蒙脫石。MMT負載ZnO后，特征衍射峰未發生明顯變化，說明負載后的MMT仍為鈣型蒙脫石。根據JCPDS卡片對比，在31.7°、34.4°、36.2°左右均發現有ZnO晶體(100)、(002)和(101)的晶面衍射，說明在蒙脫石表面或內部有ZnO生成，這與文獻[11]的測定結果相符。隨著反應溫度的升高，ZnO晶體的衍射角和晶面間距基本不變，但衍射峰強度發生變化，且在70 ℃時強度最大，說明70 ℃時ZnO/MMT復合抗菌材料中ZnO晶體數量最多。晶相分析表明：ZnO在蒙脫石表面或內部生成，與蒙脫石載體表面牢固結合形成穩定的復合物，二者存在著較強的界面關系。

圖1 MMT and ZnO/MMT的X射線衍射圖Fig.1 XRD patterns of MMT and ZnO/MMT samples

研究了不同溫度該抗菌材料的比表面積、孔體積及孔徑分布(表4)。與MMT相比， ZnO/MMT的孔體積增大，孔徑減小，這可能是由于ZnO微粒堆積形成小孔，使材料孔體積變大，微粒吸附于MMT孔道內導致材料孔徑變小所致[12]。在70 ℃時，ZnO/MMT比表面積為53.7534 m2/g，較80、90和100 ℃條件下制備的ZnO/MMT的比表面積大很多，且孔徑最小，說明隨著反應溫度的升高，ZnO微粒可能發生了團聚，導致孔徑變大，孔體積變小。負載ZnO前后蒙脫石孔結構的變化顯示ZnO在蒙脫石表面或內部均有生成，這與XRD表征的結果一致。

表4 材料的比表面積孔體積和孔徑Table 4 Specific surface area, pore volume and pore size of materials

圖2 MMT(a)和ZnO/MMT(b-e)復合抗菌材料和的SEM圖Fig.2 SEM images of MMT (a) and ZnO/MMT (b-e) composite antibacterial materials

圖2a-e分別為載體MMT和制備溫度為70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃下ZnO/MMT復合抗菌材料的SEM圖。由圖2a可知蒙脫石載體形貌呈片層結構。在70 ℃時，ZnO晶體以針狀和棒狀的形態吸附在MMT片層表面及空隙中，較為疏松(圖2b)。升高溫度，ZnO晶體的形貌特征不再明顯，空隙消失，發生團聚現象(圖2c-e)。這可能由于煅燒溫度調控了納米氧化鋅顆粒的粒徑，使其表面能高、表面張力大，從而使納米氧化鋅顆粒團聚[13]。

3.4 ZnO/MMT的廣譜抑菌活性

廣譜活性是評價抗菌材料的重要依據之一。因此，研究了最優制備條件下ZnO/MMT復合抗菌材料對沙門氏菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌效果，見圖3所示。作為陰性對照，MMT對這三種菌的生長無抑制作用，而ZnO/MMT復合材料對三個菌種均發現明顯的抑菌圈，說明該條件下制備的ZnO/MMT對沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長均具有廣譜抑制效果，其抗菌機理可能是復合材料細菌直接相互作用，引起細菌表面損傷，繼而導致菌膜破裂最終引發細菌死亡[14]，抗菌機理的深入研究還在進行中。

同時，還研究了該材料對三個菌種的MIC和MBC。由表5可知，ZnO/MMT對各試驗菌株均表現出一定程度的抑制能力，這一結論與抑菌圈實驗結果一致。抑菌活性順序為：沙門氏菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌。