‘鳳丹’牡丹葉軸多糖超聲輔助提取工藝優化及抗氧化性研究

馬曉，陳剛，梁盼

（1.河南職業技術學院，河南 鄭州 450046；2.鄭州師范學院，河南 鄭州 450044）

‘鳳丹’牡丹為芍藥屬落葉亞灌木，是中國栽培牡丹品種的近緣野生種之一[1]。‘鳳丹’牡丹又稱為銅陵牡丹、銅陵鳳丹，屬于江南品種群，其根皮具有解熱、陣痛和消炎等醫用作用，是一種名貴藥材，《中藥大辭典》明文記載：“安徽省銅陵鳳凰山所產丹皮質量最佳”，所以被稱為鳳丹[2]。近期研究表明，鳳丹牡丹種子出油率為27%～33%，籽油含大量不飽和脂肪酸（＞90%），特別是α-亞麻酸含量達39%以上。由于α-亞麻酸對于保護心血管、抑制癌癥發生等具有顯著的生理活性，具有較高的醫療保健價值[3]。因此，‘鳳丹’不僅有一定的觀賞價值，還可以體現其藥用價值和油用價值[4]。

多糖是一種能維持人體生命活動正常運轉的重要生物大分子[5]。植物多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗衰老、降血糖等多種生物活性、毒副作用小和不易造成殘留等優點[6-7]。常用的提取方法有：熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法和酶法[8]。近年來將超聲輔助提取技術在多糖提取工藝中應用的越來越廣泛[9]。植物多糖提取過程主要包含兩個物理現象：細胞膜的通透性增大，多糖從細胞膜中滲出；細胞膜破裂后多糖從細胞中流出[10]。超聲波輔助提取主要是通過超聲波的空化作用和強烈振動使物體內部產生振蕩、收縮，增加分子的運動頻率和速率，破碎原料細胞壁，促進多糖的溶出，提高多糖的得率[11]。除了能夠提髙提取效率外，該方法還有縮短提取時間、減少試劑消耗和降低提取溫度等優點，有利于保持熱穩定性較差的有效成分的結構和活性不被破壞[12]。

由于‘鳳丹’牡丹的經濟價值，其種植面積將逐年擴大[13]，但在實踐中，牡丹葉軸往往在采收種子后丟棄，不僅浪費資源，還對環境造成污染。有關優化超聲輔助提取牡丹葉軸多糖工藝條件，尚未見相關報道，對其抗氧化活性也缺乏研究[14]。因此本試驗以‘鳳丹’牡丹葉軸作為試驗材料，通過單因素試驗和正交試驗，優化超聲輔助提取‘鳳丹’牡丹葉軸多糖的最佳工藝，并對其抗氧化活性進行評價，為更好地開發與利用‘鳳丹’牡丹葉軸提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2017年10月在鄭州采摘的七年生實生苗‘鳳丹’牡丹葉軸。選取生長旺盛、無病蟲害、長約35 cm，粗細均勻的葉軸，去除葉軸上的葉柄帶回實驗室備用。

無水乙醇、濃硫酸、過硫酸鉀、葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖、蔗糖等（均為分析純）：Sigma 公司；2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：合肥巴斯夫生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：阜陽曼林生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

智能溫控雙頻超聲波合成/萃取儀（XH-2008DE）：北京祥鵠科技發展有限公司；新世紀紫外可見分光光度計（T6）：北京普析通用儀器有限責任公司；電熱鼓風干燥箱（DHG-9140）：上海一恒科技儀器有限公司；電子天平（JA3003N）：上海菁海儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-S8）：上海越磁電子科技有限公司；旋風磨（FOSS SCINO CT410）：杭州嘉維創新科技有限公司；超純水機（minI）：湖南科爾頓水務有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 混標糖標準曲線的建立

參考王婉冰等[15]的方法，有改進。用天平稱取50 mg的混標糖（葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖、蔗糖，每種各10 mg）放入燒杯，加蒸餾水，攪拌，待溶解后定容至100 mL，取20 mL 再次定容至100 mL 備用。用移液槍分別量取含 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 混標糖體積的混合液于編號1 至8 號的試管中，分別補充蒸餾水，使每支試管的溶液體積均達到1.0 mL，蒽酮硫酸比色法[16]測吸光度，擬合線性回歸方程。

1.3.2 牡丹葉軸多糖的測定

牡丹葉軸清洗干凈后置于干燥箱中，60 ℃烘干至恒重，用旋風磨將其粉碎后過50 目篩；稱1.0 g 牡丹葉軸粉末加入相應的蒸餾水攪拌均勻，用超聲波萃取器進行提取，將提取液過濾，4 000 r/min 離心10 min 后，取上清液備用。按1.3.1 的方法進行測定，重復3 次，按照標準曲線計算其多糖得率：

式中：C 為提取液中多糖的濃度，mg/mL；V 為提取上清液體積，mL；N 為稀釋倍數；m 為樣品質量，g。

1.3.3 牡丹葉軸多糖提取的單因素試驗

在液料比為 20 ∶1（mL/g）、超聲時間為 40 min、超聲功率為250 W 的條件下，考察超聲溫度為20、30、40、50、60、70 ℃對多糖得率的影響。

在超聲溫度為50 ℃、超聲時間為40 min、超聲功率為 250 W 的條件下，考察液料比為 8 ∶1、12 ∶1、16 ∶1、20 ∶1、24 ∶1、28 ∶1（mL/g）對多糖得率的影響。

在超聲溫度為 50 ℃、液料比為 20 ∶1（mL/g）、超聲功率為250 W 的條件下，考察超聲時間為10、20、30、40、50、60 min 對多糖得率的影響。

在超聲溫度為 50 ℃、液料比為 20 ∶1（mL/g）、超聲時間為40 min 的條件下，考察超聲功率為100、150、200、250、300、350 W 對多糖得率的影響。

1.3.4 ABTS+自由基清除率測定

參考朱玉昌等[17]的方法，有改動。稱ABTS 0.096 g，用蒸餾水定容至25 mL，稱0.3784 g 過硫酸鉀，用蒸餾水定容至 10 mL，量取 5 mL 的 ABTS 溶液與 88 μL 的過硫酸鉀溶液混合均勻，在室溫（25 ℃）避光的條件下靜置過夜，制成ABTS+自由基儲備液，在12 h～16 h 之內測定，測定時用無水乙醇稀釋，使其在734 nm 波長下的吸光度為0.7±0.02。將樣品液及VC標準品配制成500、250、125、62.5、31.25、15.375、7.687 5 μg/mL 的樣品液。分別取各濃度的樣品液0.2 mL，加入3 mL ABTS+自由基儲備液，充分混合，室溫放置20 min 用紫外分光光度計在734 nm 處測定吸光值；空白管用蒸餾水替代樣品液。以抗壞血酸（VC）作為陽性對照。重復3 次。按照以下公式計算清除率：

式中：A空白為蒸餾水代替樣品液所測得吸光值；A樣品為樣品溶液所測得吸光值。

1.3.5 DPPH 自由基清除率測定

參考孫麗萍等[18]的方法，有改動。精確取0.019 7 g的DPPH 粉末，用無水乙醇溶解定容至250 mL，配制成0.2 mmol/L 的DPPH 自由基儲備液，0 ℃保存。將樣品液及 VC標準品配制成 500、250、125、62.5、31.25、15.375、7.6875 μg/mL 的樣品液。分別取各濃度的樣品液 0.5 mL，加入 2.5 mL 的 DPPH 自由基儲備液，在 28 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min，用紫外分光光度計于517 nm處測定吸光度，以抗壞血酸（VC）作為陽性對照。重復3次。按照以下公式計算清除率：

式中：A空白為無水乙醇代替樣品液所得吸光值；A樣品為樣品溶液所測得吸光值。

1.4 數據處理

試驗數據均為3 次重復試驗的平均值，用Microsoft Excel 2010 進行整理，用SPSS13.0 對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 混標糖標準曲線

根據不同質量分數的混標糖溶液以及其對應的吸光度，所做的擬合線性方程為：y=0.822 4x+0.014 8，R2=0.993 5，式中：y 為吸光度值；x 為混標糖含量（mg/mL）。

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 超聲溫度對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響

超聲溫度對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響見圖1。

圖1 超聲溫度對多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on the polysaccharide yield

由圖1 可知，20 ℃到50 ℃的多糖得率隨著超聲溫度的升高而增大，當超聲溫度為50 ℃時多糖得率為10.664 7 mg/g，達到最大，但是當超聲溫度高于50 ℃時，多糖得率開始下降。這可能是由于多糖溶解度隨溫度的升高而增大；但當溫度繼續升高時，由于多糖的熱不穩定性而發生分解，多糖得率下降[19]。方差分析結果表明，超聲溫度為50 ℃時的多糖得率顯著（p＜0.05）大于其他處理水平的多糖得率。因此，超聲溫度以50 ℃為宜。

2.2.2 液料比對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響

液料比對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響見圖2。

圖2 不同液料比對多糖得率的影響Fig.2 Effect of different ratio of liquid to material on the polysaccharide yield

如圖2所示，液料比在 8 ∶1（mL/g）至 20 ∶1（mL/g）的范圍內，多糖得率是不斷增加的。隨著液料比的升高，蒸餾水用量逐漸增大。當液料比達到20 ∶1（mL/g）后，得率隨蒸餾水用量的增加而呈降低趨勢。當蒸餾水增加時，其與蒸餾水的接觸面積增加，有利于多糖溶出。當蒸餾水量過多時，蒸餾水會吸收超聲波的輻射，從而使細胞破壁作用降低，多糖得率趨于緩慢降低[20]。方差分析結果表明，液料比 20 ∶1（mL/g）時的多糖得率顯著（p＜0.05）高于其他處理水平。因此，液料比以 20 ∶1（mL/g）為宜。

2.2.3 超聲時間對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響

超聲時間對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the polysaccharide yield

由圖3 可知，10 min 到30 min 內，多糖得率隨超聲時間的延長而增加，當超聲時間達到30 min 時，多糖得率最大，為11.256 5 mg/g，繼續延長提取時間，多糖得率反而開始下降，可能是由于超聲時間過長，多糖在高溫下部分化學結構發生破壞[21]，最終影響多糖的得率。方差分析結果表明，超聲時間為30 min 時的多糖得率，顯著（p＜0.05）大于其他處理水平的多糖得率。因此，超聲時間以30 min 為宜。

2.2.4 超聲功率對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響

超聲功率對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the polysaccharide yield

由圖4 可以看出，在100 W 至250 W 范圍內，隨超聲功率不斷增加，多糖得率也隨之增加，當超聲功率超過250 W 時，多糖得率開始下降。可能是因為在一定超聲功率范圍內，提高超聲功率有利于促進細胞壁的破裂和溶液傳質作用，從而提高了多糖得率；但較大的超聲功率產生出一定的剪切作用而使多糖組分中糖苷鍵斷裂，所以呈下降趨勢[22]。方差分析結果表明，超聲功率為250 W 時的多糖得率顯著（p＜0.05）高于其他處理水平。因此，超聲功率以250 W 為宜。

2.3 超聲輔助提取牡丹葉軸多糖正交試驗結果與分析

在單因素試驗基礎上，采用L（934）正交試驗，對超聲溫度、液料比、超聲時間、超聲功率等4 個因素進行優化，正交試驗因素水平設計與試驗結果分別如表1、表2所示。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

表2 正交試驗設計與極差分析結果Table 2 Orthogonal experimental design and range analysis results

由表2 可以看出，在所選取得的4 個單因素中，極差的大小順序依次為B＞C＞D＞A；說明對牡丹葉軸多糖得率影響最大的是液料比（B），超聲溫度（A）對牡丹葉軸多糖得率的影響最小。根據分析可以得到各個因素的最優水平為A3B3C3D1，即在超聲溫度為60 ℃，液料比為24 ∶1（mL/g），超聲時間為40 min，超聲功率為200 W 時，‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率最大，按此工藝條件進行3 次驗證試驗，得出最優組合提取條件下的多糖得率為（11.328 8±0.525 3）mg/g，高于正交試驗中任一提取工藝組合的多糖得率。與傳統提取工藝[液料比為 20 ∶1（mL/g），不進行超聲處理，浸泡 30 min 后直接過濾測定]的多糖得率（7.867 3 mg/g）相比，最優組合提取的多糖得率比傳統提取工藝高43.998 6%。

方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果Table 3 The results of variance analysis

由表3 可知，超聲溫度、液料比、超聲時間和超聲功率4 個試驗因素均達到顯著（p＜0.05）水平，表明這4 個因素均顯著（p＜0.05）地影響到了多糖的得率。

2.4 牡丹葉軸多糖提取物對自由基的清除作用

2.4.1 牡丹葉軸多糖提取物對ABTS+自由基的清除能力

牡丹葉軸多糖提取物對ABTS+自由基的清除能力見圖5。

圖5 多糖提取物對ABTS+自由基的清除能力Fig.5 Scavenging ability of the polysaccharide extract on ABTS+free radical

ABTS 在反應體系中被氧化，生成穩定的藍綠色ABTS+自由基，734 nm 處有特征吸收峰，加入自由基清除劑（如多糖類化合物、VC等）會使顏色減弱，吸光度減小，顏色變化的程度可反應自由基清除劑清除自由基的能力[23]。由圖5 可知，在一定的濃度下，牡丹葉軸多糖提取物和VC對ABTS+自由基均具有較好的清除作用，并且隨著濃度的增加，對ABTS+自由基的清除效果越好。在試驗條件下，當牡丹葉軸多糖提取物濃度在 500 μg/mL 和 VC濃度為 250 μg/mL 時清除率均達到了100%。分析得出牡丹葉軸多糖提取物和VC對ABTS+自由基清除率的 IC50分別為 19.316 7 μg/g 和31.430 4 μg/g。

2.4.2 牡丹葉軸多糖提取物對DPPH 自由基的清除能力

多糖提取物對DPPH 自由基的清除作用見圖6。

圖6 多糖提取物對DPPH 自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of polysaccharide extract on DPPH free radical

DPPH 自由基是一種穩定的含氮自由基，結構中存在單電子，在乙醇溶液中顯深紫色，在517 nm 處有特征吸收。多糖類化合物多數都具有羥基，可以提供氧原子，與DPPH 自由基結構中的孤對單電子配對，從而減少單電子數目，使吸收減弱，顏色變淺或者消失。根據顏色變化程度就可以判定自由基的清除程度[24]。由圖6 可知，牡丹葉軸中提取的多糖化合物對DPPH自由基的清除作用隨多糖提取物濃度的增加，其清除能力也逐漸加強，表明了牡丹葉軸多糖提取物對DPPH 自由基的清除能力與其濃度有著明顯的量效關系。在試驗條件下，當牡丹葉軸多糖提取物濃度在500 μg/mL 時對DPPH 自由基清除率達到了89.567 9%。分析得出牡丹葉軸多糖提取物和VC對DPPH 自由基清除能力的 IC50分別為 39.330 0 μg/g 和 40.790 0 μg/g，牡丹葉軸多糖提取物和VC對DPPH 自由基清除能力相近。

3 結果與討論

本文使用超聲輔助提取‘鳳丹’牡丹葉軸中的多糖，考察了超聲溫度、液料比、超聲時間和超聲功率這4 個單因素對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響。通過正交試驗對超聲輔助提取‘鳳丹’牡丹葉軸多糖的條件進行優化，得出最佳工藝條件是：超聲溫度為60 ℃，液料比為 24 ∶1（mL/g），超聲時間為 40 min，超聲功率為200 W 時，牡丹葉軸多糖得率為（11.328 8±0.525 3）mg/g。

通過對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖提取物的體外抗氧化試驗可知，在試驗所選取的濃度范圍內‘鳳丹’牡丹葉軸多糖提取物對ABTS+自由基、DPPH 自由基均有較強清除作用。當牡丹葉軸多糖提取物濃度在500 μg/mL 時ABTS+自由基清除率達到了100%，牡丹葉軸多糖提取物對ABTS+自由基清除能力的IC50為19.316 7 μg/g；當牡丹葉軸多糖提取物濃度在500 μg/mL 時對DPPH自由基清除率達到了89.567 9%，牡丹葉軸多糖提取物對DPPH 自由基清除能力的IC50為39.330 0 μg/g，牡丹葉軸多糖具有較強的抗氧化活性，是天然抗氧化劑的良好來源。