刺梨葉總黃酮超聲輔助提取工藝優(yōu)化

李欣燃，朱淼，韓世明，向紅，王緒英

（六盤(pán)水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤(pán)水 553004）

刺梨葉為薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）植物刺梨（Rosa roxburghii Tratt）葉片，在《本草綱目》、《草木便方》、《中華本草》、《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）等古今典籍中均有記錄，具有健胃消食、清熱解暑、止血、解毒療瘡等功效，可用于治療積食飽脹、疥痛金瘡、外傷出血等癥[1-2]。

黃酮類(lèi)化合物是植物中源自苯丙氨酸和乙酸代謝的重要次級(jí)代謝產(chǎn)物[3-4]，具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗心腦血管疾病、抗癌、抗Ⅱ型糖尿病、降血糖、降血脂等多種生物學(xué)活性[5-11]，此類(lèi)化合物廣泛存在于蔬菜與水果中，對(duì)人體健康起到重要作用。因此，從植物體內(nèi)提取黃酮類(lèi)化合物已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

刺梨葉中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物、維生素C 和多糖等成分[12-14]，然而對(duì)于刺梨葉中生物有效成分提取工藝的優(yōu)化未見(jiàn)報(bào)道。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)曲面法對(duì)刺梨葉中總黃酮提取工藝進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，以期建立一條實(shí)用有效的刺梨葉黃酮提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨葉（4月份）采摘于六盤(pán)水師范學(xué)院校內(nèi)，經(jīng)六盤(pán)水師范學(xué)院王緒英教授鑒定；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純）：北京化學(xué)試劑廠；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1800 型）：上海菁華科技儀器有限公司；超聲波清洗機(jī)（SB-800DT）：寧波新芝生物科技股份有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（BGZ-30）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電子分析天平（ATY124）：沈陽(yáng)龍騰電子標(biāo)量?jī)x器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品及標(biāo)準(zhǔn)品制備

刺梨葉采收后洗凈，再用蒸餾水清洗，放置空曠處自然晾干，在40 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，用粉碎機(jī)粉碎，備用。

采用硝酸鋁顯色法測(cè)定葉片中黃酮含量[15]，取0.1 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品至100 mL 容量瓶中，加60%乙醇定容。分別取配置好的標(biāo)準(zhǔn)品 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 于25 mL 容量瓶中，加入0.7 mL 的5%NaNO2混勻放置室溫6 min，加入0.7 mL 的10%Al（NO）3混勻放置室溫6 min 后，再加入10 mL 1 mol/L NaOH，用60%乙醇補(bǔ)齊至25 mL，混勻后放置室溫15 min，在510 nm 處測(cè)量其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：y=10.314x+0.006 9，R2=0.993 6。

黃酮得率/%=提取液中黃酮質(zhì)量/葉片干粉質(zhì)量×100

1.3.2 提取物單因素試驗(yàn)

按料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL），加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，超聲時(shí)間為30 min共 6 個(gè)水平；按超聲浸提時(shí)間 10、20、30、40、50、60 min，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，料液比1 ∶30（g/mL）共6 個(gè)水平；按乙醇溶液濃度40%、50%、60%、70%、80%、90%，超聲浸提時(shí)間 30 min，料液比 1 ∶30（g/mL）共6 個(gè)水平，分別以刺梨葉干粉為原料，在超聲功率為800 W，提取溫度為60 ℃的條件下，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Design-Expert8.0.6 軟件中的Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)條件選取上述3 個(gè)單因素試驗(yàn)中的最適范圍附近3 個(gè)數(shù)值，以黃酮化合物得率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，所有試驗(yàn)保持超聲功率為800 W，提取溫度為60 ℃不變，優(yōu)化刺梨葉黃酮類(lèi)化合物提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)黃酮得率影響

料液比對(duì)黃酮得率影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)黃酮得率的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of flavonoids

由圖1 可知，隨著溶劑體積的增加，刺梨葉黃酮得率逐漸升高，當(dāng)料液比達(dá)到 1 ∶30（g/mL）時(shí)，刺梨葉黃酮得率趨于平衡，再增加溶劑體積，黃酮得率變化不大。還會(huì)增加黃酮提取液濃縮工藝難點(diǎn)和生產(chǎn)成本，故認(rèn)為料液比選取1 ∶30（g/mL）左右為宜。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

由圖2 可知，刺梨葉總黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈先增加后下降趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%左右時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)，黃酮得率顯著降低，這可能是由于不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇極性不同，根據(jù)相似相容原理，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，刺梨葉黃酮類(lèi)化合物得率達(dá)到最大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷增大，有機(jī)溶劑與刺梨葉黃酮類(lèi)化合物間的極性差異逐漸增加，導(dǎo)致其溶出量減少，黃酮類(lèi)化合物得率下降。綜合考慮溶劑用量以及提取率方面，認(rèn)為刺梨葉黃酮類(lèi)化合物在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50 %～70%之間的溶解性較好。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率影響

提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響如圖3所示。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Effect of exetraction time on the yield of flavonoids

由圖3 可知，隨著超聲時(shí)間不斷增加，黃酮類(lèi)化合物得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到30 min 時(shí)，黃酮類(lèi)化合物得率達(dá)到最大，當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)30 min 后，乙醇溶劑不斷揮發(fā)損失，黃酮類(lèi)化合物穩(wěn)定性逐漸變差，其中一些熱敏性組分被破壞，導(dǎo)致得率降低。考慮黃酮類(lèi)化合物得率和提取效率，認(rèn)為選擇超聲提取時(shí)間30 min 最佳。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件

2.2.1 回歸模型建立與分析

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken 原理設(shè)計(jì)提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Bxo-Behnken experimental design and corresponding results

續(xù)表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 1 Bxo-Behnken experimental design and corresponding results

通過(guò)Design-Expert8.0.6 對(duì)黃酮得率的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)表1 中響應(yīng)面與各因素進(jìn)行回歸擬合，得到刺梨葉黃酮類(lèi)化合物得率（Y）與料液比（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=-27.831 25+0.312 37A+0.374 25B+0.708 63C+4×10-4AB-6.75×10-4AC-8.5×10-4BC-3.8375×10-3A2-5.1125×10-3B2-5.837 5×10-3C2。

對(duì)擬合方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 2 Analysis of variance of each term in the response surface regression model

由表2 的方差分析可知，回歸方程模型差異極顯著（P＜0.01），方程失擬項(xiàng)差異不顯著，說(shuō)明該方程回歸模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度較高。各項(xiàng)方差分析表明A、B、C、B2、C2對(duì)黃酮得率有極顯著影響，A2對(duì)黃酮得率有顯著影響。各單因素對(duì)黃酮得率的影響力大小順序?yàn)锳＞C＞B，即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面圖與等高線(xiàn)圖分析

為了進(jìn)一步考察分析提取條件優(yōu)化過(guò)程中各變量之間的交互作用，利用Design-expert8.0.6 軟件對(duì)響應(yīng)曲面圖和等高線(xiàn)圖進(jìn)行繪制，如圖4、圖5 及圖6所示。

圖4 料液比與提取時(shí)間對(duì)黃酮化合物得率的影響Fig.4 Interaction effects of liquid-to-solid ratio and extraction time on the yield of flavonoids

圖5 料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮化合物得率的影響Fig.5 Interaction effects of liquid-to-solid ratio and ethanol concentration on the yield of flavonoids

圖6 提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮化合物得率的影響Fig.6 Interaction effects of extraction time and ethanol concentration on the yield of flavonoids

響應(yīng)面坡度越陡峭，顏色變化越劇烈，等高線(xiàn)呈橢圓形，則說(shuō)明響應(yīng)面對(duì)此操作條件的變化較敏感，即對(duì)黃酮得率影響較大。由圖4～圖6 可以看出，其各因素交互作用對(duì)響應(yīng)面坡度變化較平緩，等高線(xiàn)基本呈圓形，說(shuō)明AB、AC、BC 之間的交互作用不強(qiáng)，對(duì)刺梨葉黃酮得率影響較弱，且響應(yīng)值隨著各因素的增加逐漸增大，當(dāng)達(dá)到一定極限后又開(kāi)始降低。另外，由各單因素的坡度變化可知，料液比對(duì)黃酮得率影響大于乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間的作用。

2.3 提取工藝優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)回歸方程模型得到的最佳工藝條件為料液比 1 ∶35.75（g/mL），提取時(shí)間 33.80 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)57.05%，在此條件下，黃酮得率預(yù)測(cè)值可達(dá)41.36 mg/g。為便于試驗(yàn)操作，將最佳提取工藝條件修正為料液比1 ∶36（g/mL），提取時(shí)間 34 min，乙醇體積分?jǐn)?shù) 57%，并在此條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到刺梨葉黃酮的實(shí)際得率平均值為（40.87±0.09）mg/g。該值與理論預(yù)測(cè)值比較相近，因此認(rèn)為利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化刺梨葉黃酮提取工藝具有可行性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以刺梨葉為原材料，采用超聲輔助提取，提取溫度60 ℃，在考察料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間3 個(gè)單因素的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)刺梨葉黃酮提取的影響力大小為料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化刺梨葉黃酮提取的最佳條件，即料液比為1 ∶36（g/mL）、提取時(shí)間 34 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)57 %、提取3 次，黃酮化合物的提取率可達(dá)（40.87±0.09）mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.21%。

響應(yīng)曲面法應(yīng)用于刺梨葉黃酮提取方法具有直觀性和高效性，是目前用于工藝優(yōu)化的有效方法之一[16]，通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)際得率40.87 mg/g 與預(yù)測(cè)得率41.36 mg/g 相近，該模型擬合度較好，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果具有一定的實(shí)用價(jià)值，這也為刺梨葉黃酮類(lèi)化合物工業(yè)生產(chǎn)提供一定的參考依據(jù)。