黃驊蝦醬的微生物學和理化性質研究

吳小禾，耿曉杰，張建旭，桑亞新，孫紀錄，*

（1.中山火炬職業技術學院生物醫藥系，廣東 中山 528436；2.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001）

蝦醬是一種在東亞和東南亞地區流行的傳統調味品，由蝦鹽腌發酵而成[1-2]。傳統發酵食品不僅具有較高的營養價值和獨特的風味，還含有很多生理活性成分[3]。但是，許多傳統發酵食品是在作坊或家庭內進行加工[4]。它們主要采用天然發酵，受外部環境等條件的影響，其品質不穩定，還可能存在一定的安全性問題，例如，菌落總數超標，高鹽環境、發酵過程產生的生物胺[5-7]，揮發性鹽基氮，丙二醛和亞硝酸鹽等。

蝦醬發酵過程中，產生微生物學的和生物化學的變化。其中，蛋白質水解是蝦醬發酵期間發生的一種重要的生化反應。它由蝦中內源性蛋白酶以及在高鹽條件下存活的嗜鹽細菌產生的蛋白酶引起。蛋白質水解引發低分子量化合物的形成，如，肽、氨基酸和胺類，發酵過程中也會產生有害的代謝產物，從而影響發酵產品的質地和風味[2]。另外，腐胺的增加和鹽厭氧菌屬的增長有關[8]。所以，自然發酵產品的微生物菌群在產品感官、品質中起著重要的作用。

生物胺作為人體的正常活性成分可促進生長和代謝，增強腸道系統免疫活性，并在神經系統中發揮作用[9]；但是，高濃度的生物胺將造成人體神經系統和心血管系統損傷[10]。食品中的生物胺主要由氨基酸經脫羧酶類催化的脫羧反應產生，最常見的生物胺是組胺、腐胺、尸胺、亞精胺和精胺[11]。生物胺可以作為食品和含酒精飲料的質量和新鮮度的指標[12]。但是，由于大部分生物胺沒有熒光和紫外發色基團，因此需經衍生化后才能測量[9]。本研究采用丹磺酰氯柱前衍生的高效液相色譜方法測定黃驊蝦醬的生物胺含量。

在每個國家或地區，制作蝦醬的原料、發酵溫度、鹽濃度、pH 值和加工過程往往不同[13]，因此，每種蝦醬可能具有不同的名稱、顏色、理化特性、感官特性以及功能特性。本研究旨在對黃驊蝦醬的微生物學和理化特性進行系統分析，以評價黃驊蝦醬的安全性，并為其傳統發酵方法的改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦醬：5 種，購自黃驊海園市場（家庭自制，3 種，分別編號為XJ1、XJ2、XJ3）和黃驊耀華商廈（工場生產，2種，分別編號為 XJ4、XJ5）。

伊紅美藍瓊脂、平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）、孟加拉紅瓊脂和乳酸細菌液體（De Man，Rogosa and sharpe，MRS）瓊脂培養基：北京索萊寶科技有限公司。

硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）：國藥集團化學試劑有限公司；乙腈，色譜純：福晨（天津）化學試劑有限公司；1，1，3，3-四乙氧基丙烷（丙二醛乙縮醛）、標準品（組胺二鹽酸鹽，純度≥99%；酪胺鹽酸，純度≥98%；2-苯乙胺，純度 ≥ 98 %；色胺，純度≥ 98 %；尸胺二鹽酸鹽，純度≥98%；腐胺，純度≥98%；精胺，純度≥97%；亞精胺，純度≥98%）、衍生劑（丹磺酰氯，純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters Breeze 高效液相色譜儀：沃特世公司；3-18K 型高速冷凍離心機：Sigma 公司；FA-stlab 水分活度測定儀：法國GBX 公司；DTD 超聲波清洗機：寧波新制生物科技股份有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；HD-850 桌上式潔凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；DHP-500 電熱恒溫培養箱：上海科恒實業發展有限公司；PHS pH 計：合肥橋斯儀器設備有限公司；721G 可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；XHF-DY 高速分散器：山東博科生物產業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蝦醬的微生物學分析

購買蝦醬樣品之后，立刻進行蝦醬的微生物學分析[7]。在試管中，將1 g 樣品和9 mL 無菌生理鹽水混合，震蕩2 min，充分混勻，制成10-1稀釋度的菌懸液；然后，吸取1 mL 10-1菌懸液于9 mL 無菌生理鹽水中，制成10-2菌懸液，充分混勻；依次作10 倍逐級稀釋，制成10-3、10-4菌懸液；通過傾注平板法進行微生物計數分析。PCA 培養基用于菌落總數測定；孟加拉紅瓊脂培養基用于計數酵母菌和霉菌；伊紅美藍瓊脂培養基用于計數致病性腸桿菌[1]；含有 10%NaCl（pH 7.5）的PCA 用于計數嗜鹽細菌；含有1%CaCO3和10%NaCl（pH 7.5）的MRS 瓊脂培養基用于計數乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB），計數具有透明圈的菌落；含有10%NaCl 和1%酪蛋白酸鈉（pH 7.5）的PCA 用于計數水解蛋白的細菌，計數具有透明圈的菌落[2]。對于酵母菌和霉菌，在30 ℃培養5 d；對于所有嗜溫性細菌和致病性腸桿菌，在37 ℃培養2 d；嗜鹽細菌、乳酸菌和水解蛋白的細菌，在37 ℃培養5 d。菌落計數結果報告為每克樣品的菌落形成單位（colony forming units，CFU）的對數（lg CFU/g）[1]。所有的平板計數進行平行試驗并做空白對照以確保準確性。

1.3.2 蝦醬的理化性質分析

1.3.2.1 pH 值測定

在試管中，將2 g 蝦醬和10 mL 蒸餾水混合，振蕩 2 min，充分混勻，室溫（25 ℃）靜置 5 min，取出上清液，測定樣品的pH 值，每種樣品測定3 次以確保準確性[14]。

1.3.2.2 鹽分測定

采用直接滴定法（GB/T 5009.39-2003《醬油衛生標準的分析方法》）。

1.3.2.3 水分含量測定

采用直接干燥法（GB 5009.3-2016《食品安全國家標食品中水分的測定》）。

1.3.2.4 水分活度測定

采用水分活度儀擴散法（GB 5009.238-2016《食品安全國家標食品中水分活度的測定》）。

1.3.2.5 丙二醛含量測定

采用分光光度法（GB 5009.181-2016《食品安全國家標食品中丙二醛的測定》）。

1.3.2.6 亞硝酸鹽含量測定

采用分光光度法（GB 5009.33-2016《食品安全國家標食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》）。

1.3.2.7 揮發性鹽基氮測定

采用自動凱氏定氮法（GB 5009.228-2016《食品安全國家標食品中揮發性鹽基氮的測定》）。

1.3.2.8 生物胺含量的測定

采用高效液相色譜法（GB 5009.208-2016《食品安全國家標食品中生物胺的測定》）。

1）生物胺標準溶液的配制。

2）樣品處理：準確稱取蝦醬樣品2.5 g，置于50 mL離心管中；加入25 mL 0.1 mol/L HCl，混勻；在高速分散器內16 000 r/min 均質1 min；然后，在20 ℃條件下，在離心機內6 500 r/min 離心30 min；過濾[7]。

3）生物胺的衍生：取1 mL 標準溶液/濾液于10 mL離心管內；加入 200 μL 2 mol/L NaOH、300 μL 飽和NaCO3、1 mL 丹磺酰氯（10 mg/mL 丙酮溶解），黑暗中，40 ℃水浴 45 min；加入 100 μL 氨水，避光反應 30 min；最后，用乙腈定容到5 mL。用濾膜（0.22 μm）將上述樣品過濾至進樣瓶，供液相色譜檢測[7]。

4）高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 條件：WondaSil C18色譜柱：5 μm，4.6 mm×250 mm，Tokyo，Japan；流速：0.8 mL/min；柱溫：40 ℃；波長：254 nm；進樣量：20 μL；流動相：流動相 A為0.1%的乙酸銨，流動相B 為乙腈；梯度洗脫程序：0.01 min～10 min，35 %；10 min～15 min，20 %；15 min～30 min，10%；30 min～35 min，35%[15]。

2 結果與分析

2.1 黃驊蝦醬的微生物學分析

2.1.1 蝦醬的菌落總數分析

黃驊蝦醬中的菌落總數情況見圖1。

圖1 黃驊蝦醬中的菌落總數Fig.1 Aerobic bacterial count in Huanghua shrimp paste

菌落總數是食品安全的一個重要標準。由圖1 可知，在5 種受試樣品中，只有家庭自制的XJ3 中菌落總數（5.40 lg CFU/g）大于食品安全標準規定的水產調味劑中菌落總數（5 lg CFU/g）；其它4 種蝦醬均合格，XJ1、XJ2、XJ4 和 XJ5 中菌落總數分別為 2.81、2.91、0.92、2.44 lg CFU/g，總體來看，工廠生產的蝦醬中的菌落總數低于家庭自制的蝦醬。

2.1.2 蝦醬的嗜鹽性細菌數量分析

黃驊蝦醬中的嗜鹽性細菌數量情況見圖2。

圖2 黃驊蝦醬中的嗜鹽性細菌數Fig.2 Halophilic bacteria count in Huanghua shrimp paste

蝦醬屬于高鹽食品。由圖2 可知，5 種受試蝦醬中均含有一定數量的嗜鹽性細菌，其中，家庭自制的XJ3中嗜鹽性細菌數量最多（6.28 lgCFU/g），其它4 種蝦醬XJ1、XJ2、XJ4 和 XJ5 中的嗜鹽性細菌數量分別為1.78、3.04、2.78、1.89 lgCFU/g。Pongsetkul J 等的研究結果揭示，Kapi 蝦醬中的主要微生物也是嗜鹽性細菌[2]。有研究表明，恒溫發酵蝦加工副產物，在高鹽度下，只有耐鹽/嗜鹽性細菌生長，有效地抑制了腐敗菌，發酵的產品更美味[13]。

2.1.3 蝦醬的酵母菌和霉菌數量分析

黃驊蝦醬中的酵母菌和霉菌數量情況見圖3。

由圖3 可知，受試黃驊蝦醬樣品中真菌數量較少，僅在家庭自制的XJ1 和XJ3 中檢出了真菌，數量分別為0.50 lg CFU/g 和1.66 lg CFU/g，而在其它3 種蝦醬中，沒有真菌檢出。Cheok C Y 等的研究表明，辣椒蝦醬中的真菌數也較少，為2.43 lg CFU/g[1]。

圖3 黃驊蝦醬中酵母菌和霉菌數Fig.3 Yeast and mold counts in Huanghua shrimp paste

2.1.4 蝦醬的致病性腸桿菌數量分析

黃驊蝦醬中的致病性腸桿菌數量情況見圖4。

圖4 黃驊蝦醬中致病性腸桿菌數Fig.4 Pathogenic enterobacteriaceae count in Huanghua shrimp paste

由圖4 可知，在5 種受試的蝦醬樣品中，除了工廠生產的XJ4，其它4 種都有致病性腸桿菌的檢出，XJ1、XJ2、XJ3 和 XJ5 中的致病性腸桿菌數分別為 1.29、0.63、2.28 lgCFU/g 和 0.50 lgCFU/g，家庭自制的 XJ3 中數量最高?？傮w來看，工廠生產的蝦醬中，致病性腸桿菌數量少于家庭自制蝦醬。

2.1.5 蝦醬的分解蛋白質的細菌和乳酸菌數量分析

在受試的5 種蝦醬樣品中，均未檢出乳酸菌和分解蛋白質的細菌。這可能由于樣品為終產品，鹽度較高不利于這些微生物的長期存活。在以后的試驗中，可以采用宏基因組測序技術[16]，對蝦醬進行微生物多樣性分析，以更好地了解蝦醬各個發酵時期的微生物區系組成，分析蝦醬的生物安全性與微生物菌群之間的關系[17]。

2.2 黃驊蝦醬的理化性質分析

2.2.1 蝦醬的一般理化指標分析

黃驊蝦醬的一般理化指標情況見表1。

由表1 可以看出，5 種受試蝦醬中的食鹽含量都低于國家安全標準（25%），均為合格。謝主蘭等[18]的研究表明，食鹽添加量為15%～18%的低鹽蝦醬，也具有較好的防腐作用，并利于風味物質的形成，保持高品質特征。受試蝦醬的pH 值均在7.0～8.0 之間，可能是由于蛋白質過度水解，產生生物胺等堿性物質，從而使pH 值升高[19]。各蝦醬樣品的水分活度均在0.70～0.90之間，對一般細菌的生長有抑制作用。根據水產行業標準，蝦醬中水分含量應≤60%。因此，受試蝦醬的水分含量整體偏高，只有工廠生產的XJ5 在該項目達標。

表1 黃驊蝦醬的一般理化指標Table 1 General physicochemical indicators of Huanghua shrimp paste

2.2.2 蝦醬的丙二醛含量分析

黃驊蝦醬中的丙二醛測定和含量情況分別如圖5和圖6所示。

圖5 丙二醛標準曲線Fig.5 Malonaldehyde standard curve

圖6 黃驊蝦醬中丙二醛的含量Fig.6 Malondialdehyde content in Huanghua shrimp paste

丙二醛含量是衡量油脂氧化程度的一個重要指標。在油脂的國家標準中，丙二醛含量≤0.25 mg/kg，對于蝦醬中的丙二醛，目前尚無適用標準。由圖6 可知，家庭自制與工廠生產的蝦醬中都含有丙二醛，XJ1、XJ2、XJ3、XJ4 和 XJ5 中的含量分別為 4.53、0.80、1.55、0.14、0.94 mg/kg，其中家庭自制的 XJ1 含量最高，工廠生產的XJ4 含量最低。整體而言，相對于工廠生產的蝦醬，家庭自制蝦醬內丙二醛含量更高。

2.2.3 蝦醬的亞硝酸鹽含量分析

黃驊蝦醬中的亞硝酸鹽測定和含量情況分別如圖7 和圖8所示。

圖7 亞硝酸鈉標準曲線Fig.7 Sodium nitrite standard curve

圖8 黃驊蝦醬中的亞硝酸鹽含量Fig.8 Nitrite content in Huanghua shrimp paste

由圖8 可知，5 種受試蝦醬樣品 XJ1、XJ2、XJ3、XJ4和 XJ5 中的亞硝酸鹽含量分別為 0.18、0.31、0.29、0.24、0.48 mg/kg，遠遠小于我國食品安全標準（30 mg/kg），因此，受試黃驊蝦醬不存在亞硝酸鹽超標的問題。

2.2.4 蝦醬的揮發性鹽基氮含量分析

黃驊蝦醬中的揮發性鹽基氮含量情況如圖9所示。

圖9 黃驊蝦醬中的揮發性鹽基氮含量Fig.9 Volatile base nitrogen content in Huanghua shrimp paste

揮發性鹽基氮是動物性食品中蛋白質分解腐敗變質的一個重要指標。在綠色食品標準中，我國農業部對其規定的限量是≤150 mg/100 g；對于蝦醬，目前尚無明確的適用標準。從圖9 可知，5 種受試蝦醬樣品XJ1、XJ2、XJ3、XJ4、XJ5 中揮發性鹽基氮含量分別為167、400、401、271、208 mg/100 g。因此，蝦醬中揮發性鹽基氮的含量還有待降低，以使其更加安全。

2.2.5 蝦醬的生物胺含量分析

黃驊蝦醬中的生物胺含量情況如表2所示。

表2 黃驊蝦醬中的生物胺含量Table 2 The content of bovine serum albumin in Huanghua shrimp paste

美國食品和藥品監督管理局標準規定，除水產品外，其他食品中組胺含量應＜50 mg/kg，生物胺總量應≤1 000 mg/kg。歐盟規定，除水產品以外，其他食品（包括肉制品）中組胺含量應≤100 mg/kg，酪胺含量應限制在 100 mg/kg～800 mg/kg，β-苯乙胺含量應＜30 mg/kg。荷蘭乳品協會推薦，肉制品中組胺含量應限定在100 mg/kg～200 mg/kg。我國目前只限定了鮮、凍動物性水產品中組胺的含量，僅上海市制定了DB 31/2004-2012《食品安全地方標準發酵肉制品》，其中規定組胺含量應≤100 mg/kg[20]。從表2 可以看出，5 種受試蝦醬樣品中均含有一定量的生物胺；色胺只在家庭自制的XJ3 中檢出，含量為24 mg/kg；精胺、亞精胺和組胺在5種蝦醬中均未檢出；除了XJ1，在其它4 種蝦醬中，均檢出了苯乙胺；在家庭自制的XJ2 和工廠生產的XJ5中，檢出了腐胺，含量分別為445 mg/kg 和13 mg/kg；在家庭自制的XJ1、XJ3 和工廠生產的XJ5 中，檢出了尸胺，含量分別為1、391、152 mg/kg；僅在家庭自制的XJ1 和XJ2 中，檢出了酪胺?？傮w來說，家庭自制的黃驊蝦醬中生物胺含量較高。

3 結論

在受試黃驊蝦醬的微生物學特征方面，大多數樣品菌落總數合格，數量在3 lgCFU/g 以下；所有樣品中均存在嗜鹽性細菌；樣品中酵母菌和霉菌數量較低，數量在2 lgCFU/g 以下，且在多數樣品中未檢出；大多數樣品中檢出了致病性腸桿菌，數量在3.16 lgCFU/g以下；所有樣品中未檢測到乳酸菌和分解蛋白質的細菌。在受試黃驊蝦醬的理化特征方面，所有樣品的食鹽含量合格；pH 值在7.0～8.0 之間；水分活度在0.70～0.90 之間；大多數樣品的水分含量超標，在65%～80%之間；所有樣品中均檢出了丙二醛，含量在5 mg/kg 以下；亞硝酸鹽合格；所用樣品總均含有揮發性鹽基氮，含量在450 mg/100 g 以下；生物胺普遍存在，總含量均在550 mg/kg 以下。整體而言，在菌落總數、真菌數量、致病性腸桿菌數量、丙二醛、揮發性鹽基氮和生物胺這些與安全性有關的指標方面，工廠生產的蝦醬優于家庭自制的蝦醬。因此，為確保傳統發酵蝦醬對消費者的安全性，應嚴格注意和規范生產過程，包括原料的預處理、發酵條件的優化、發酵過程中有害微生物的控制和有害產物的抑制以及發酵成品的殺菌。此外，建議有關部門對傳統發酵蝦醬的品質尤其是安全性進行全面的監督，并盡快制定相關標準。