添加苦蕎黃酮提取物的裸燕麥擠壓膨化產品抗氧化及降血脂功效研究

薛朕鈺，薛淼，王雪，王聰，肖萍，2，王步江，2，劉金福，2，*

（1.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300384；2.天津市農副產品深加工技術工程中心，天津 300384）

裸燕麥本身含有豐富的營養(yǎng)物質，諸如優(yōu)質球型顆粒蛋白質、各種不飽和脂肪酸、各種可溶和不可溶纖維素和豐富的礦物質；燕麥中β-葡聚糖含量較高，可有效改善糖尿病腎病大鼠腎臟功能，延緩腎臟組織結構損傷[1-3]。燕麥中黃酮含量較低，游離型含量變幅為 128.83 μg RE/g～286.83 μg RE/g，結合型含量范圍在65.64 μg RE/g～123.05 μg RE/g，不同品種的燕麥中多酚組成存在差異顯著[4]。而苦蕎中含有豐富的生物類黃酮化合物，其主要成分為蘆丁，具有多種生理功能，如抗氧化、降血糖、降血脂和降膽固醇等作用[5]。

通過前期試驗確定了擠壓膨化工藝參數(shù)[6]，添加苦蕎黃酮提取物來增強裸燕麥擠壓膨化產品的抗氧化能力，為開發(fā)生產具有抗氧化、降血脂等生物功效的燕麥膨化食品或食品配料提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

裸燕麥：產地為內蒙古呼和浩特市；精制玉米淀粉（直鏈淀粉含量約為70%）：天津中英保健食品有限公司；苦蕎黃酮提取物（蘆丁含量為82.92%）：內蒙古通遼市開魯縣昶輝生物技術有限責任公司。

SPF 級雄性昆明小鼠、高脂飼料（含78.8%基礎飼料、10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇、0.2%膽鹽）、基礎飼料：中國食品藥品檢定研究院；膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）：英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司。

DSE-30 雙螺桿擠壓膨化機：濟南鼎潤機械設備有限公司；UV-1200 紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；pH 酸度計：奧豪斯儀器有限公司；Elmasonic P180H 超聲波清洗機：德國Elma Schmid bauer 公司；MD3000 魅力全自動生化儀：美國 MD 儀器公司；GM505K 血糖分析儀：湖南可孚醫(yī)療用品有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 擠壓膨化產品的制備

以裸燕麥與玉米淀粉混合為原料，采用DSE-30雙螺桿高溫擠壓膨化技術，螺桿轉速設定為25 Hz，喂料速度40 g/min，選用直徑為5.0 mm 的模口，物料加水量4%、IV 區(qū)膨化溫度180 ℃、燕麥與玉米淀粉的質量比4 ∶6，進行生產制備。以上述方法在燕麥與玉米淀粉混合原料中添加質量分數(shù)為1%的苦蕎黃酮提取物，按照上述工藝條件進行膨化，得到了強化苦蕎黃酮的擠壓膨化產品。

1.2.2 DPPH 自由基清除能力的測定

1.2.2.1 標準曲線的繪制

據DPPH 自由基溶液的質量濃度與吸光度的關系，得到線性方程：y=0.263 3x-0.001 2，R2=0.999 6，RSD=0.96%。

圖1 DPPH 標準曲線Fig.1 DPPH standard curve

1.2.2.2 燕麥膨化產品的DPPH 自由基清除能力測定方法

取兩支試管，一支加入2 mL DPPH 溶液和2 mL待測樣品溶液；另一支試管中加入2 mL DPPH 溶液和2 mL 超純水，混合均勻后，靜置 30 min，在 517 nm 處測其吸光度。重復3 次，取平均值。

待測樣品經過與DPPH 自由基作用后，DPPH 自由基的剩余量可由下式得到：

DPPH 自由基剩余量/%=（DPPH 自由基 t/DPPH自由基 0）×100[7]

式中：DPPH 自由基0 為0 時刻體系中DPPH 自由基的起始質量濃度，mg/mL；DPPH 自由基t 為t 時刻體系中DPPH 自由基的質量濃度，mg/mL；以100%減去DPPH 自由基的剩余含量，即為樣品對DPPH 自由基的清除率。

1.2.3 羥基自由基清除能力的測定方法

在試管中先后加入6 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液2 mL，待測樣品2 mL，6 mmol/L 的過氧化氫溶液2 mL，搖勻，靜置10 min，接著加入6 mmol/L 的水楊酸溶液2 mL，搖勻，放置在37 ℃的水浴鍋中加熱30 min，然后取出試管，在510 nm 處測得吸光度值（Ai），另取2 支試管，分別做空白（Ac）和樣品對照（Aj）。

待測樣品對羥自由基的清除率按照下列公式計算：清除率/%=1-（Ai-Aj）/Ac×100

1.2.4 鐵離子還原能力測定方法

取一支試管，加入1 mL 的待測樣品，再加入1 mL質量濃度為1%的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后，放入50 ℃水浴鍋中水浴20 min，急速冷卻后，在3 000 r/min離心10 min，然后取上清液1 mL，加入1 mL 蒸餾水和200 μL 的氧化鐵溶液。另取一支試管做對照試驗。在700 nm 處測得吸光度值。吸光度值越大表明對鐵離子的還原能力越強[8]。

1.2.5 高脂動物模型建立和分組及血清指標測定

40 只健康SPF 級雄性昆明小鼠，體重15 g～20 g。適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為5 組，每組8 只。分別為空白對照組（CK）、高脂模型陽性對照組（AC）、未加黃酮膨化組（WJH）、添加黃酮膨化組（TJH）、苦蕎黃酮提取物組（KH）。空白對照組飼喂基礎飼料，其余各組飼喂高脂飼料4 周建立高脂小鼠模型后，高脂模型組與苦蕎黃酮組繼續(xù)飼喂高脂飼料，未加黃酮膨化組飼喂燕麥膨化食品，添加黃酮膨化組飼喂苦蕎黃酮強化膨化食品（蘆丁含量為0.613%）。

空白對照組、高脂模型組、無黃酮膨化組、添加黃酮膨化組給予蒸餾水灌胃4 周，苦蕎黃酮組給予400 mg/kg 苦蕎黃酮提取物灌胃4 周。

血清指標測定：末次灌胃后禁食12 h，乙醚麻醉后，摘眼球取血，所取血液4 ℃靜置20 min，4 000 r/min離心20 min，吸出上清液即為血清，采用全自動生化儀測定 TC、TG、HDL、LDL 的含量。

葡萄糖耐量（oral glucose tolerance test，OGTT）實驗：末次給藥后禁食12 h，尾部取血用血糖儀測定空腹血糖值（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），然后各組經口給予葡萄糖 2.5 g/kg，測定灌胃葡萄糖后 0、0.5、1、2 h 的血糖值。并按下式方法分別計算血糖下面積（AUC）[9]。

血糖下面積（AUC）=（空腹血糖+0.5 h 血糖值）×0.5/2+（0.5 h 血糖值+1 h 血糖值）×0.5/2+（1 h 血糖值+2 h 血糖值）/2 1.2.6 數(shù)據處理

采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學組間t 檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 清除DPPH自由基的能力

樣品的DPPH 自由基清除率見表1。

表1 樣品DPPH 自由基清除率Table 1 DPPH scavenging rate of samples

由表1 可知膨化前原料和膨化后產品的DPPH 自由基清除率相近，約為40.86%，其起到抗氧化作用的可能主要為燕麥本身含有的β-葡聚糖、多酚類物質等，添加1%苦蕎黃酮提取物后，DPPH 自由基清除率顯著上升，與膨化前原料相比增長了72.34%，說明強化苦蕎黃酮類物質在抗氧化功效方面作用顯著。

2.2 清除羥自由基的能力

樣品對羥自由基清除能力如圖2所示。

圖2 羥基自由基清除率Fig.2 Hydroxyl radical scavenging rate

膨化前原料對羥自由基的清除率為51.45 %，膨化后產品對羥基自由基的清除能力有所降低，抗氧化活性受到影響。添加1%苦蕎黃酮提取物的燕麥膨化產品對羥自由基的清除率達到88.33%，進一步證實了膨化產品中添加黃酮類化合物可顯著增強清除羥自由基的能力，提高抗氧化活性。

2.3 三價鐵離子的還原能力

樣品對鐵離子還原能力的測定如圖3所示。

圖3 鐵離子的還原能力測定Fig.3 Determination of iron ion reduction

通過原料及產品對鐵離子還原能力的測定，在700 nm 處測得4 種樣品的吸光度大小排列為：添加1%苦蕎黃酮膨化產品＞膨化前原料＞膨化后產品。吸光度越高代表對三價鐵還原能力越高，說明添加苦蕎黃酮提取物對燕麥膨化食品抗氧化能力有顯著提升。

2.4 高脂動物模型血脂4 項指標的統(tǒng)計分析

小鼠灌胃前后攝食量、飲水量和體重指標如圖4～6所示。

圖4 灌胃后各組小鼠攝食量變化Fig.4 Change of food intake in mice after gavage

圖5 各組小鼠飲水量變化Fig.5 Changes of water content in each group mice

圖6 各組小鼠體重變化Fig.6 Changes of body weight in each group mice

試驗中空白對照組灌胃后攝食量穩(wěn)定水平，趨于中間水平；未加黃酮膨化組更換飼料前飲水量較大趨于平穩(wěn)狀態(tài)且更換飼料后飲水量有所降低后趨于平穩(wěn)；更換飼料前小鼠體重呈上升趨勢至最高體重51.42g，更換飼料后小鼠體重平穩(wěn)下降狀態(tài)；添加黃酮膨化組更換飼料前飲水量平穩(wěn)且更換飼料后飲水量有所提升后呈上下波動形態(tài)，更換飼料前小鼠體重呈上升趨勢，體重增長迅速，更換飼料后呈平穩(wěn)下降趨勢后逐漸趨于平穩(wěn)狀態(tài)；苦蕎黃酮組灌胃前小鼠飲水量較大，灌胃后迅速降低，且呈波動狀態(tài)略有提升，灌胃前小鼠體重逐漸升高后趨于平穩(wěn)，灌胃后小鼠體重略有降低，但體重依然較高且保持平穩(wěn)狀態(tài)。

小鼠血清指標的測定結果如表2所示。

表2 各組小鼠脂代謝相關指標測定結果（，n=6）Table 2 The lipid metabolism parameter of rats in each group（，n=6）

表2 各組小鼠脂代謝相關指標測定結果（，n=6）Table 2 The lipid metabolism parameter of rats in each group（，n=6）

注：同一列肩注字母不同表示組間有顯著差異P＜0.05，含有相同字母表示組間無顯著差異P＞0.05。

組別 TG/（mmol/L） TC/（mmol/L） HDL/（mmol/L）LDL/（mmol/L）CK 0.81±0.07c 2.63±0.28c 2.34±0.24c 0.20±0.11c AC 1.24±0.12a 4.39±0.23a 2.30±0.19b 0.74±0.08a TJH 0.80±0.05c 3.64±0.21b 3.75±0.20a 0.35±0.06bc WJH 1.11±0.14ab 4.18±0.16ab 3.64±0.15ab 0.55±0.06ab KH 0.94±0.14bc 4.57±0.45ab 3.63±0.32ab 0.63±0.05a

分析可知高脂模型組與空白對照組小鼠的各項指標均有顯著性的差異（P<0.05），表明造模后的高脂小鼠糖脂代謝發(fā)生明顯紊亂。通過4 周提取物的灌胃與更換飼料后飼喂的TG、TC、HDL、LDL 指標對比中發(fā)現(xiàn)，添加黃酮膨化組與高脂模型組小鼠存在顯著性差異（P<0.05），其中TG 與 LDL 含量其與空白對照組小鼠相比無顯著差異，說明小鼠甘油三酯的代謝和低密度脂蛋白的水平恢復明顯，HDL 含量與空白對照組小鼠相比有所提升，說明添加1%苦蕎黃酮提取物的擠壓膨化食品對高脂小鼠的糖脂代謝有積極的影響；未加黃酮膨化組的血脂4 項指標與高脂模型組比較無顯著差異（P＞0.05），但 TG、TC、LDL 含量指標有所降低，HDL 含量有所升高，說明燕麥擠壓膨化產品對小鼠血脂4 項水平也存在一定的影響，可能是因為產品中含有β-葡聚糖和抗性淀粉的作用。

2.5 高脂動物模型葡萄糖耐量和血糖下面積

各組小鼠糖耐量的變化如圖7所示。

高脂模型組大鼠葡萄糖耐量與空白對照組相比有較為明顯的上升，血糖急劇上升，添加苦蕎黃酮提取物的擠壓膨化食品對小鼠糖耐量有較好的調節(jié)作用，血糖上升水平最低；未添加提取物的膨化產品組小鼠與空白對照的糖耐量相似，但血糖下降趨勢相對緩慢；

各組小鼠血糖下面積（AUC）的變化如圖8所示。

圖7 各組小鼠糖耐量的變化（，n=6）Fig.7 Changes of glucose tolerance in mice in each group（，n=6）

圖8 各組小鼠血糖下面積（AUC）的變化（，n=6）Fig.8 Changes of AUC in mice of each group（，n=6）

對各組小鼠的血糖下面積進一步分析可知，加黃酮膨化組小鼠的血糖下面積顯著低于其余各組（P<0.05），未添加提取物組與添加提取物組小鼠的血糖下面積相近，與高脂模型組小鼠相比有所下降，程度不明顯，而添加組小鼠血糖下面積與空白對照組有顯著的降低（P<0.05）。

3 結論與討論

本研究前期試驗對擠壓膨化原料、擠壓膨化前后黃酮類物質含量的變化進行了研究，發(fā)現(xiàn)在一定的擠壓膨化條件下，黃酮類物質有一定的損失，但并不十分顯著[6]，進而可對強化黃酮類物質的產品的生物活性作進一步的研究。試驗發(fā)現(xiàn)生產原料具有抗氧化能力，可能主要與燕麥中含有的β-葡聚糖、少量的多酚類物質等有關，他們具有一定的抗氧化能力。通過DPPH 自由基清除率、羥基自由基清除率和三價鐵還原能力的試驗結果可以看出，添加苦蕎黃酮提取物后的擠壓膨化產品其抗氧化能力得到顯著提高。黃酮類化合物等的抗自由基活性與其結構中的C 環(huán)C3 位的羥基基團和B 環(huán)上的鄰位二羥基結構密切相關[10]，從試驗結果來看，在高溫高壓擠壓膨化加工的條件下，羥基基團還具有相當?shù)姆€(wěn)定性，保持了較高的清除自由基的能力。從Fe3+被還原為Fe2+的能力也可以看出，強化了苦蕎黃酮提取物的燕麥擠壓膨化產品的還原性、抗氧化活性得到明顯增強。

在高脂動物模型對比實驗中，通過4 周提取物的灌胃與更換飼料喂養(yǎng)小鼠的對比發(fā)現(xiàn)，未加黃酮膨化組的血脂4 項指標中TG、TC、LDL 指標有所降低。醫(yī)學界普遍認為β-葡聚糖具有清腸、調節(jié)血糖、降低膽固醇、提高免疫力4 大生理作用[11]。添加苦蕎黃酮提取物的擠壓膨化產品對高脂血癥小鼠的糖脂代謝有積極地影響，使得高脂血癥小鼠癥狀得到改善，調整了糖脂代謝機能，可能使其胰島、肝臟等器官的功能得到改善和恢復；而在糖耐量指標中，苦蕎膨化組低于空白對照組模型但不顯著，而添加苦蕎黃酮組顯著低于空白對照組，可能是苦蕎黃酮提取物和燕麥β-葡聚糖均有降血脂的功效，從而進一步降低了糖耐量指標。前期試驗還發(fā)現(xiàn)，添加苦蕎黃酮提取物的產品淀粉結構有所變化，抗性淀粉的含量有一定的增加，也可能是降低血脂水平的原因之一。可見，利用擠壓膨化技術強化一定量的黃酮類物質可以開發(fā)生產具有更強生物活性的食品。

燕麥和淀粉混合原料對DPPH 自由基的清除率達到41.06%、對羥自由基的清除率是51.45%；原料經擠壓膨化后的膨化產品對DPPH 自由基的清除率達到40.68%、對羥自由基的清除率是48.53%；添加1%苦蕎黃酮提取物的燕麥擠壓膨化產品對DPPH 自由基的清除率達到70.76%、對羥自由基的清除率是88.33%；對三價鐵離子的還原能力分別為添加1%苦蕎黃酮膨化產品0.317、膨化前原料0.236、膨化后產品0.213。

添加苦蕎黃酮提取物的裸燕麥擠壓膨化產品對高脂血癥小鼠具有較好的糖脂代謝調節(jié)作用，在血脂指標TG、HDL、HDL、LDL 中，加黃酮膨化組與高脂模型組存在顯著性差異（P＜0.05），其中 TG 與 LDL 含量與空白對照組相比無顯著差異；HDL 含量有顯著性提升，其糖耐量與血糖下面積顯著優(yōu)于其余各組。以燕麥和淀粉為主要原料進行擠壓膨化食品的生產中通過強化苦蕎黃酮提取物可顯著提高膨化產品的抗氧化能力，改善小鼠糖脂代謝紊亂效果更加明顯，此技術可用于生產具有更好生物功能的擠壓膨化食品或食品配料。