大鼠尿液與血液中海洛因4種代謝物的檢測(cè)時(shí)限研究

王璐瑩，倪春芳，姜鳳麗，徐智儒，汪 蓉，張玉榮

（1.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 創(chuàng)新藥物與制藥工藝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203；

2.上海市公安局物證鑒定中心 上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200083；3.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海200031）

海洛因（Heroin），是一種以嗎啡生物堿為合成起點(diǎn)的半合成毒品。從20世紀(jì)開始，海洛因?yàn)E用就已經(jīng)成為危害人類健康，影響社會(huì)穩(wěn)定的一個(gè)重要問(wèn)題[1]。海洛因主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生先興奮后抑制的作用，具有很強(qiáng)的成癮性，吸食者一旦停止吸食，會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)烈的戒斷癥狀，嚴(yán)重危害人體健康。

海洛因的代謝極為迅速（圖1），半衰期只有2～5min[2]，在體內(nèi)迅速去乙酰化成O6-單乙酰嗎啡（6-MAM），進(jìn)而水解轉(zhuǎn)變?yōu)閱岱龋∕OR），代謝產(chǎn)物嗎啡與β-D-葡萄糖醛酸發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，分別生成3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡（M3G）、6-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡（M6G）[3]。

目前國(guó)內(nèi)外已有一些研究海洛因代謝物檢測(cè)時(shí)限的報(bào)道[4-7]，但尚未同時(shí)系統(tǒng)地比較尿液、血液中4種海洛因代謝物的檢測(cè)時(shí)限。本研究通過(guò)測(cè)定海洛因給藥后大鼠尿液與血液中近兩周內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的代謝物的含量，并且同時(shí)比較4種代謝物的檢測(cè)時(shí)限，篩選出尿液與血液中檢測(cè)時(shí)限最長(zhǎng)的代謝物，為海洛因吸食者體內(nèi)代謝物檢測(cè)時(shí)限的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Spark 1240液相系統(tǒng)（荷蘭Spark公司）；API 4000 QTRAP質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）。

6-MAM和MOR（中國(guó)藥品生物制品檢定所），M3G、M6G，嗎啡-d3（MOR-d3）、3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡-d3（M3G-d3）和 6-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡-d3（M6G-d3）（美國(guó) Cerilliant公司）。 超純水由 ELGA純水儀制備，甲醇、乙腈和異丙醇（德國(guó)Merck公司）。其他試劑均為分析純。

1.2 溶液配制

混合工作液：取6-MAM、MOR、M3G和M6G標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度分別為500、1 000、100、100 μg/mL，用超純水稀釋為混合濃度分別為10、5、20、20μg/mL的混合工作液和混合濃度分別為40、20、20、20μg/mL的混合工作液。

混合內(nèi)標(biāo)工作液：取MOR-d3、M3G-d3和M6G-d3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度都為100μg/mL，用超純水稀釋為混合濃度分別為2、4、4μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)工作液。

上述溶液保存于4℃冰箱備用。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為WatersXBridge?C18（3.0mm×150 mm，3.5 μm）；保護(hù)柱為Waters XBridge?C18（3.0 mm×20 mm，3.5 μm）；柱溫為 40℃；進(jìn)樣量為100μL，流速為0.4mL/min；流動(dòng)相為1%氨水（A相）和乙腈（B相），梯度洗脫程序見表1：

表1 梯度洗脫程序

圖1 海洛因的代謝過(guò)程

質(zhì)譜條件：電離模式為ESI+，掃描方式為MRM，離子噴霧電壓為5500V，離子噴霧溫度為600℃，氣簾氣（CurtainGas）為 30psi，碰撞氣（CAD）為 Medium，霧化氣（GS1）為 50psi，輔助氣（GS2）為 60psi。各分析物的MRM優(yōu)化參數(shù)及內(nèi)標(biāo)應(yīng)用見表2。

表2 各分析物的MRM優(yōu)化參數(shù)

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、給藥方法及樣本制備與采集

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

種屬品系：SD大鼠（上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0006；性別：雄性；體重：200～220 g；動(dòng)物合格證號(hào)：NO.201000 2608556；飼養(yǎng)條件：SPF清潔級(jí)小動(dòng)物屏障系統(tǒng)，室溫23±1℃，濕度50%～70%，人工照明模擬晝夜變化，自由進(jìn)食與飲水。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2014-0018。

1.4.2 藥液配制及給藥方法

藥液配制：稱量海洛因樣品適量，加生理鹽水溶解并稀釋至1mg/mL濃度的溶液。

給藥方法：SD大鼠，雄性16只，隨機(jī)分為兩組，每組8只，10mg/kg尾靜脈注射給藥。一組用于收集尿液，另一組取血液。

1.4.3 樣本采集

尿液樣本：給藥后分別收集0～8 h、8～11 h、11～24h、24～48h、48～72h、72～96h、96～120h、120～144h、144～168 h、168～180 h、180～192 h、192～216 h、216～264 h、264～312 h、312～336 h 的大鼠尿液樣品，編號(hào)，并于-40℃冰箱冷凍保存。

血液樣本：給藥后于 0.5、1、2、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312 h，眼眶靜脈叢取全血約200 μL，編號(hào)，并于-40℃冰箱冷凍保存。

1.5 樣品前處理

1.5.1 預(yù)處理方法

尿液：取100 μL尿液樣品，置于離心管中，加入10 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液和100 μL磷酸鹽緩沖溶液（pH=4），渦旋混勻，18 407×g 離心 10 min，取上清液100μL進(jìn)樣。

血液：取100 μL血液樣品，置于離心管中，加入10 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液和200 μL磷酸鹽緩沖溶液（pH=4），渦旋混勻，18 407×g 離心 10 min，取上清液100μL進(jìn)樣。

1.5.2 在線固相萃取方法

采用全自動(dòng)的Spark online SPE-LC系統(tǒng)（荷蘭Spark公司），在線固相萃取小柱是OASIS?On-Line SPE，MCX （10mm，96/pkg）柱。以 1mL/min 的流速依次用5%氨水甲醇1mL、甲醇1mL和超純水1mL活化固相萃取柱；以1mL/min的流速用磷酸鹽緩沖液（pH=4）1mL平衡固相萃取柱；以0.8mL/min的流速用磷酸鹽緩沖液（pH=4）0.5 mL輔助上樣；再以1 mL/min的流速用0.1mol/L鹽酸溶液0.5mL、超純水0.5 mL和0.15 mol/L碳酸銨溶液0.5 mL淋洗雜質(zhì)；最后用流動(dòng)相（1%氨水和乙腈）洗脫供LC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 檢測(cè)限、定量限和線性范圍

取適量混合工作液逐級(jí)稀釋并加入空白基質(zhì)（尿液和血液）中，分別配制標(biāo)準(zhǔn)曲線尿液樣品（MOR濃度為 2.5～500 ng/mL，6-MAM 濃度為 5～1 000 ng/mL，M3G和M6G濃度都為10～2000ng/mL）和標(biāo)準(zhǔn)曲線血液樣品（MOR 濃度為 2.5～1 000 ng/mL，6-MAM濃度為10～2000ng/mL，M3G和M6G濃度都為2.5～1 000 ng/mL），進(jìn)行預(yù)處理，再進(jìn)樣分析，以分析物的濃度為橫坐標(biāo)，分析物面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)物面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，尿液和血液中4種代謝物標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，線性關(guān)系良好。以信噪比（S/N）大于等于3確定檢測(cè)限（LOD），大于等于10確定定量限（LOQ）。尿液和血液中4種代謝物的檢測(cè)限、定量限、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表3。

2.1.2 精密度、準(zhǔn)確度和方法回收率

將低、中、高濃度的質(zhì)控樣品（尿液、血液的質(zhì)控樣品濃度分別見表4和表5）以及標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品進(jìn)行預(yù)處理，再進(jìn)樣分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算質(zhì)控樣品的測(cè)定濃度。每個(gè)濃度5份樣品，并連續(xù)測(cè)定3 d，分別考察日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度及日間精密度和準(zhǔn)確度。精密度用RSD（%）來(lái)表示，準(zhǔn)確度=測(cè)定濃度/理論濃度×100%。尿液中各分析物日內(nèi)精密度、準(zhǔn)確度和日間精密度、準(zhǔn)確度見表4。尿液中4種代謝物的日內(nèi)精密度介于0.4%～6.7%之間，日內(nèi)準(zhǔn)確度介于92.9%～101.7%之間，日間精密度介于1.8%～7.3%之間，日間準(zhǔn)確度介于94.4%～101.5%之間。血液中各分析物日內(nèi)精密度、準(zhǔn)確度和日間精密度、準(zhǔn)確度見表5。血液中4種代謝物的日內(nèi)精密度介于1.0%～8.6%之間，日內(nèi)準(zhǔn)確度介于90.8%～103.7%之間，日間精密度介于2.4%～7.5%之間，日間準(zhǔn)確度介于94.3%～104.4%之間。

參照已報(bào)道文獻(xiàn)[8]，將低、中、高的質(zhì)控樣品3份進(jìn)行預(yù)處理，再進(jìn)樣分析；取相應(yīng)濃度的質(zhì)控溶液，添加相同體積的超純水代替空白基質(zhì)，其余步驟不變，從而進(jìn)行方法回收率的驗(yàn)證。方法回收率用各分析物在質(zhì)控樣品中的峰面積與其在超純水中的峰面積的比值來(lái)表示，綜合反映分析方法的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率。尿液結(jié)果見表4，4種代謝物的方法回收率介于33.9%～90.3%之間。血液結(jié)果見表5，4種代謝物的方法回收率介于19.3%～89.5%之間。

表3 尿液和血液中4種代謝物的檢測(cè)限、定量限和線性范圍

表4 尿液中4種代謝物在不同濃度下日內(nèi)和日間的精密度、準(zhǔn)確度及方法回收率

表5 血液中4種代謝物在不同濃度下日內(nèi)和日間的精密度、準(zhǔn)確度及方法回收率

2.2 大鼠尿液中海洛因代謝物檢測(cè)時(shí)限

海洛因在體內(nèi)的代謝極為迅速，吸食海洛因后很難檢測(cè)到原體，本文主要測(cè)定海洛因的4種代謝物（6-MAM、MOR、M3G和M6G）。 采用上述在線固相萃取結(jié)合LC-MS/MS分析方法，測(cè)定給藥后不同時(shí)間段的大鼠尿液中4種代謝物的含量。圖2是1~8號(hào)大鼠尿液中4種代謝物的含量隨時(shí)間變化的曲線圖，表6是1~8號(hào)大鼠尿液中4種代謝物的最長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)限。

圖2 大鼠尿液中4種海洛因代謝物濃度-時(shí)間曲線圖

表6 大鼠尿液中4種海洛因代謝物的最長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)限及對(duì)應(yīng)濃度

2.3 大鼠血液中海洛因代謝物檢測(cè)時(shí)限

采用上述在線固相萃取結(jié)合LC-MS/MS分析方法，測(cè)定給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠血液中4種代謝物的含量。圖3是A號(hào)-H號(hào)大鼠血液中4種代謝物的含量隨時(shí)間變化的曲線圖，表7是A號(hào)~H號(hào)大鼠血液中4種代謝物的最長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)限。

圖3 大鼠血液中4種海洛因代謝物濃度-時(shí)間曲線圖

表7 大鼠血液中4種海洛因代謝物的最長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)限及對(duì)應(yīng)濃度

2.4 分析討論

海洛因在體內(nèi)先去乙酰化生成6-MAM，再生成MOR，最后與葡萄糖醛酸形成兩個(gè)結(jié)合物排出體內(nèi)。研究表明[9]，兩個(gè)葡萄糖醛酸結(jié)合物M3G和M6G在體內(nèi)的含量不同，M6G的含量為M3G含量的15%左右。從本研究中也可看出，無(wú)論是在尿液還是血液中，都是以M3G存在形式為主。

圖2顯示，8只大鼠尿液中6-MAM的起始含量不高，且在短時(shí)間內(nèi)快速降低直至檢測(cè)不到；MOR的起始含量也不高，但其呈緩慢下降的趨勢(shì)，檢測(cè)時(shí)限最長(zhǎng)；M3G的起始含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他3種代謝物，前48 h的含量水平較高；M6G的含量整體較低，且檢測(cè)時(shí)限非常短。由表6可見，大鼠尿液中檢測(cè)時(shí)限最長(zhǎng)的海洛因代謝物是MOR，檢測(cè)時(shí)限可達(dá)到 180-192h （7.5～8d）。 已有文獻(xiàn)報(bào)道[10]，人尿液中6-MAM含量很少且存在一般不會(huì)超過(guò)8h，最多也不會(huì)超過(guò)24h。在本實(shí)驗(yàn)中，6-MAM在大鼠尿液中存在時(shí)間最長(zhǎng)可到72～96 h，比文獻(xiàn)中報(bào)道的時(shí)間長(zhǎng)，可能原因是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)直接靜脈給藥，濃度較高，且大鼠的代謝與人體存在差異。

圖3顯示，8只大鼠血液中4種代謝物含量的變化與尿液中的變化有部分差別。大鼠血液中6-MAM的起始含量較高，在較短時(shí)間內(nèi)快速降低直至檢測(cè)不到；MOR在整個(gè)過(guò)程中緩慢下降，檢測(cè)時(shí)限較長(zhǎng)；M3G在血液中的含量較低，在部分大鼠血液中的檢測(cè)時(shí)限較長(zhǎng)；M6G在代謝過(guò)程中未檢測(cè)到。由表7可見，大鼠血液中檢測(cè)時(shí)限較長(zhǎng)的是MOR，檢測(cè)時(shí)限可達(dá)到 288 h（12 d），A、B 和 C 號(hào)大鼠血液中M3G檢測(cè)時(shí)限達(dá)到312 h（13 d），與其他大鼠差別較大，考慮可能是大鼠之間代謝的差別。

本研究結(jié)果表明，大鼠尿液和血液樣品中存在穩(wěn)定且檢測(cè)時(shí)限較長(zhǎng)的代謝物都是MOR，最長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)限超過(guò)1周，且在血液中的檢測(cè)時(shí)限明顯比尿液中的更久，最長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)限近2周。與陳躍等[7]關(guān)于家兔唾液與血液中海洛因代謝物的檢測(cè)時(shí)限研究相比，本研究同時(shí)比較了海洛因4種代謝物的檢測(cè)時(shí)限。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，可以了解海洛因代謝物在大鼠尿液和血液中最長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)限的情況，為海洛因吸食者體內(nèi)代謝物檢測(cè)時(shí)限的研究提供參考，但由于種屬差異，以及實(shí)際案例中海洛因吸食量的變化，人體內(nèi)海洛因代謝物的檢測(cè)時(shí)限還有待進(jìn)一步研究。

3結(jié)論

本研究采用在線固相萃取結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用的方法，測(cè)定了海洛因給藥后大鼠尿液與血液中4種代謝物在不同時(shí)間的含量，同時(shí)比較了尿液與血液中4種代謝物的檢測(cè)時(shí)限，篩選出在大鼠體內(nèi)存在穩(wěn)定且檢測(cè)時(shí)限較長(zhǎng)的代謝物，大鼠尿液中檢測(cè)時(shí)限最長(zhǎng)的代謝物是MOR，檢測(cè)時(shí)限可達(dá)到180～192 h（7.5～8 d）；大鼠血液中檢測(cè)時(shí)限較長(zhǎng)的是MOR，檢測(cè)時(shí)限可達(dá)到288h（12d），此結(jié)果為海洛因吸食者體內(nèi)代謝物檢測(cè)時(shí)限的研究提供了參考。