高效液相法測定黃連降糖片中鹽酸小檗堿含量

張 健，張蒙蒙

(開封市食品藥品檢驗所，河南 開封475002 )

黃連降糖片為開封市某醫院自制制劑，由黃連、酒大黃、知母、麥冬、地黃、牡丹皮組成，具有清熱生津、降糖止渴的功效，主治熱盛津傷型消渴病。方中黃連清熱保津、瀉火解毒，是為君藥，其有效成分為小檗堿。已有動物實驗和臨床研究表明作為異喹啉類生物堿，小檗堿具有多種藥理作用[1]，可通過促進胰島B細胞修復作用、拮抗腎上腺素、抑制糖異生、促進葡萄糖酵解、降低胰高血糖素等途徑降低血糖，從而改善高血糖癥，改善胰島素耐受性[2]；可降低血清三酰甘油、膽固醇、極低密度脂蛋白，升高SOD活性、抑制醛糖還原酶活性等[3]。 現用質量標準為醫院自定標準，標準中無含量測定項。為更好控制其質量、完善標準，本研究采用高效液相法對制劑中鹽酸小檗堿進行了含量測定[4-5]。實驗結果表明，本法簡便、快速、準確，可用于該制劑的含量測定。

1 藥品、試劑與儀器

黃連降糖片，0.3 g/片，60片/瓶，編號001，002，003，由開封市某醫院提供。鹽酸小檗堿對照品，含量為86.8%，由中國藥品生物制品檢定所提供，批號110713-201613；乙腈、甲醇，均為色譜純，北京迪瑪歐泰科技發展中心產品；磷酸二氫鉀，分析純試劑，天津市致遠化學試劑有限公司產品；庚烷磺酸鈉，分析純試劑，天津市光復精細化工研究所生產；磷酸，分析純試劑，洛陽昊華化學試劑有限公司產品；水為純化水，本實驗室自制。戴安U-3000型高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾公司產品；UVIKON-XL紫外分光光度計，法國SECOMAM公司電子天平，量程0.01 mg～220 g，德國Sartorius CP225D產品；C18色譜柱(Agela Promsil，4.6 mm×250 mm，5 μm)，天津博納艾杰爾科技有限公司產品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

按照文獻[6-7]操作。色譜柱為Agela C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液[0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液和0.05 mol/L庚烷磺酸鈉溶液(1∶1)，含0.2%(L/L)三乙胺，用磷酸調pH值至3.0](41∶59)，流速1.0 mL/min，檢測波長263 nm，柱溫35.0 ℃，進樣量20 μL。理論塔板數按鹽酸小檗堿峰計算應不低于3 000。對照品、陰性對照品和供試品色譜圖見圖1 。

1.鹽酸小檗堿；A.對照品; B.缺黃連陰性對照品; C.供試品圖1 對照品、陰性對照品和供試品的HPLC色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對照品23.87 mg，置25 mL量瓶中，加沸水溶解，放冷至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻，制成0.954 8 g/L的對照品儲備液。精密量取該儲備液1 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得含量為38.19 mg/L的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取供試品10片，精密稱定，研細，精密稱取細粉0.30 g(約相當于1片)，置50 mL量瓶中，加甲醇約10 mL，超聲處理并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.3 穩定性試驗

取2.2.2項下供試品溶液，于制備完成后0，1，2，4，6，8，12，24 h分別進樣20 μL，結果峰面積RSD=0.6%(n=8)。結果表明:供試品溶液在室溫24 h內穩定性較好。

2.4 線性關系考察

分別精密量取對照品溶液2，5，10，20，30，40 μL，按上述色譜條件進行分析，以對照品進樣量(X，mg/L)對峰面積(Y)作線性回歸，回歸方程為：Y=82.40X-0.035(R=0.999 5)。結果表明：鹽酸小檗堿在0.076～1.528 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.5 重復性試驗

取同一批樣品(批號001)，按2.2.2項下方法制得供試品溶液5份，分別測定鹽酸小檗堿含量，平均含量為34.77 mg/片，RSD為0.6%。結果表明：本方法重復性良好。

2.6 精密度試驗

取對照品溶液，按2.1 色譜條件連續進樣6針，以鹽酸小檗堿峰面積計算RSD為0.1%。結果表明：儀器精密度良好。

2.7 加樣回收率試驗

稱取已知含量的樣品(批號001，測得含鹽酸小檗堿34.77 mg /片)細粉6份，每份15 mg，分為3組，每組2份；置10 mL容量瓶，每組分別精密量取對照品儲備液(0.954 8 g/L)1.5 ，1.8 ，2.0 mL，加甲醇適量，超聲處理并用甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，作為加樣回收供試品溶液；按2.1項下條件測定，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

2.8 樣品含量測定

分別精密量取3批樣品，按供試品溶液制備方法制備溶液，分別進樣20 μL，測定鹽酸小檗堿含量，結果見表2。

表2 樣品含鹽酸小檗堿測定結果

3 討 論

筆者在選擇提取溶劑時，根據鹽酸小檗堿性質，比較了甲醇、80%甲醇、50%甲醇和水，因甲醇提取效果較好，回收率高，確定其為提取溶劑。在選擇檢測波長時，取鹽酸小檗堿對照品溶液，在200～400 nm波長范圍內掃描，結果在263 nm波長處有最大吸收，故選擇263 nm為檢測波長。在選擇流動相時，分別以甲醇-水 (45∶55)、乙腈-0.05%磷酸水溶液(30∶70)、乙腈-磷酸鹽緩沖液[0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液和0.05 mol/L庚烷磺酸鈉溶液(1∶1)，含0.2%三乙胺，用磷酸調pH值至3.0](41∶59)為流動相對樣品進行測定，發現使用乙腈-磷酸鹽緩沖液(41∶59)為流動相時，色譜峰的分離度大于1.5，峰形較好，理論塔板數以鹽酸小檗堿峰計算不低于3 000，故以此為流動相。