紅花配方顆粒質量標準提高研究*

王曉偉，劉瑞新，石 巖

(1. 河南省食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450008； 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院,河南 鄭州450000； 3.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

紅花為菊科紅花屬植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，是常用的活血化瘀中藥材之一，適用于經閉、痛經、胸痹心痛、跌撲損傷、瘡瘍腫痛等證[1]。羥基紅花黃色素A、山柰素、槲皮素等黃酮類成分是紅花中的一類主要活性成分[2]。現行2015版《中國藥典》一部紅花藥材質量標準，不僅檢測了其羥基紅花黃色素A的含量，也對其山柰素的含量進行了控制[3]。紅花配方顆粒是由紅花單味中藥飲片經水提、濃縮、干燥、制粒而成，具有免煎易服、攜帶方便等優點。已有文獻[4]報道了紅花配方顆粒的質量標準研究，但僅對羥基紅花黃色素A含量進行了測定。為有效控制紅花配方顆粒的質量，筆者以2015版《中國藥典》一部中紅花項下相關內容為依據，參考《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》，建立薄層色譜法對紅花配方顆粒進行定性鑒別，采用HPLC法對紅花配方顆粒中的山柰素進行含量測定。

1 藥品、試劑與儀器

紅花配方顆粒共9批，來自X，F和W三家生產企業，具體見表1。山柰素對照品(純度93.2%，批號110861-201310)、紅花對照藥材(批號120907-201713)，均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇，為色譜純，德國Merck公司產品；水為超純水；其他試劑為分析純。硅膠G預制薄層色譜板購自青島海洋化工廠和煙臺市化學工業研究所。色譜柱Phenomenex Luna (250 mm×4.6 mm，5 μm)、YMC-Pack ODS-A(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。LC-20A高效液相色譜儀，SHIMADZU公司產品；SIGMA3-30ks高速臺式冷凍離心機，Sigma-Aldrich公司產品； Digistore薄層色譜數碼成像系統，CAMAG公司產品；XPE205電子天平，上海精密科學儀器有限公司產品；GZX-DH-400-BSII電熱恒溫干燥箱，上海躍進醫療器械有限公司產品；IKA C-MAG HP 7加熱器，IKA公司產品；XMTD-204數顯式電熱恒溫水浴鍋，上海躍進醫療器械有限公司產品；KQ-300型超聲波儀，江蘇昆山市超聲儀器有限公司產品。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 薄層特征鑒別

取本品1 g，加水20 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

另取紅花對照藥材2 g，加水50 mL，煮沸30 min，濾過，濾液濃縮至20 mL，用乙酸乙酯振搖提取2次，同法制成對照藥材溶液。按《醫療機構中藥煎藥室管理規范》中藥飲片煎煮方法相關操作規范規定，制備標準湯劑溶液。取紅花飲片，稱取紅花飲片100 g，采用砂鍋煎煮兩次：第1次加水1 400 mL，浸泡30 min，先用武火煮沸再改用文火煎煮30 min；第2次加水1 000 mL，煎煮20 min。合并兩次煎煮液，濾過，取濾液60 mL蒸干，同供試品制備方法，制成標準湯劑溶液。

吸取供試品及標準湯劑溶液各6 μL、紅花對照藥材溶液3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-甲醇(3∶7∶1∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，熱風吹干，置紫外光燈(365 nm)下檢視，結果見圖1。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點，且與標準湯劑色譜斑點保持一致。

1．紅花對照藥材； 2．供試品(批號04215101)； 3．標準湯劑圖1 紅花TLC鑒別圖譜

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件的選擇

色譜柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-4 mL/L磷酸溶液(50∶50)為流動相，檢測波長為367 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。理論板數按山柰素峰計算應不低于3 000。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液的制備：取山柰素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL含10 μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取裝量差異項下的本品，混勻，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液15 mL，置平底燒瓶中，加鹽酸溶液(15→37)5 mL,搖勻，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，轉移至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性樣品溶液的制備：按處方比例稱取輔料同法制成陰性樣品，并按照供試品的處理方法制備缺紅花的陰性樣品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和缺紅花陰性樣品溶液各10 μL，進樣。結果表明，陰性樣品色譜中在與山柰素相應的保留時間沒有色譜峰，表明輔料對山柰素的測定無干擾，以本法測定本品中山柰素的含量具有專屬性，見圖2。

A.供試品；B.對照品；C.陰性樣品圖2 供試品、對照品和陰性樣品HPLC對比圖

線性關系的考察：精密稱取山柰素對照品6.16 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇適量超聲處理使溶解，取出，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質量分數為114.822 4 mg/L的山柰素對照品貯備液；精密量取0.1，0.3，0.5，1，3，5 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質量分數分別為1.148 224，3.444 672，5.741 120，11.482 240，34.446 720，57.411 200 mg/L的對照品溶液；精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，進行測定。以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程:Y=4 603 113.999 5X-8 444.818 2，r=0.999 99。結果表明：山柰素在0.011 48～0.574 11 μg范圍內線性良好。

精密度試驗：精密吸取同一供試品(批號04215101)溶液10 μL，重復連續進樣6次，測精密度。結果：RSD為0.28%。

穩定性試驗：取供試品(批號04215101)，研細，取約0.5 g，精密稱定，按供試品溶液的制備和測定法項下操作，分別在制備后放置0，2，4，8，12，24 h進樣測定。結果：RSD為0.24%。結果表明：供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取供試品(批號04215101)，按2.2.2項下方法分別制備6份，測定山柰素的含量。結果：平均含量為0.913 2 mg/g，RSD為0.33%。

加樣回收試驗：精密稱取山柰素對照品5.05 mg，置10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成質量分數為0.023 5 g/L對照品溶液。精密量取5，10，15 mL(各3份)，分別置具塞錐形瓶中。取樣品(批號04215101)適量，研細，取約 0.25 g，精密稱定，置上述具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇20，15，10 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率250W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液15 mL，置平底燒瓶中，加鹽酸溶液(15→37)5 mL，搖勻，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，轉移至25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密吸取續濾液10 μL，注入液相色譜儀，進行測定。結果見表2。

表2山柰素加樣回收實驗結果

n=9

色譜柱耐用性試驗：分別使用3種不同品牌的色譜柱，即Phenomenex Luna (250 mm×4.6 mm，5 μm) 、YMC-Pack ODS-A (250 mm×4.6 mm，5 μm)和Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)對同一批樣品進行測定。結果：山柰素RSD為0.91%。結果表明：本法色譜柱耐用性良好。

樣品含量測定：按2.2.2項下方法制備供試品溶液，測定9批樣品中山柰素的含量，結果見表3。

表39批樣品山柰素含量測定結果

批號含量/(mg·g-1)042151010.913 2042151020.701 9042151030.767 4201807010.690 6201807020.737 1201807030.821 51805010.660 41805020.685 21805030.676 3

按2.1項下方法制備標準湯劑，按2015版《中國藥典》一部紅花項下山柰素含量測定方法，測定標準湯劑及其制備原料紅花飲片的山柰素含量，結果見表4。

表4 標準湯劑含量測定結果

按2015版《中國藥典》一部紅花項下山柰素含量測定方法，測定X廠家所提供3批配方顆粒樣品原料紅花飲片的山柰素含量，并計算轉移率，結果見表5。

表5 3批樣品山柰素含量測定結果

3 討 論

在研究薄層色譜鑒別方法時，考察了直接用800 mL/L丙酮提取的樣品處理方法，但是這樣處理后供試品色譜分離效果較差，而使用本文方法則能較好地去除拖尾，有效地提升了色譜分離效果。同時也考察了不噴三氯化鋁試液，展開晾干后直接置紫外光燈(365 nm)下檢視，但供試品譜中疑似羥基紅花黃色素A黃色斑點沒有出現，故仍采用噴以氯化鋁試液，加熱后置紫外光燈(365 nm)下檢視的方法。供試品色譜中黃色斑點是否為羥基紅花黃色素A，有待進一步確認。另外，在實驗中，曾試用了不同廠家制備的硅膠G板，在不同的溫度和相對濕度條件下展開，結果本文所建立的紅花的鑒別方法鑒別特征清晰，對不同的層析條件耐用性較好，可作為樣品中紅花的定性鑒別方法。

在研究山柰素的含量測定方法時，分別考察了不同的提取溶劑(甲醇、800 mL/L甲醇水溶液、500 mL/L甲醇水溶液)、不同的提取方法(超聲提取法、加熱回流提取法、振搖提取法)、不同提取時間(15，30，45 min)，以及不同提取液與取樣量比例(500，200，100，50，25倍)。最終，根據提取的效率與提取完全程度確定了文中的樣品提取方法。

配方顆粒是以飲片為原料經水煎煮提取，濃縮，干燥并加適當輔料制成的顆粒，很好的解決了標準湯劑煎煮耗時且服用量大等問題，其臨床應用日漸廣泛[5]。然而由于不同廠家所選用飲片原料和生產工藝不同，一品多家的配方顆粒其內在質量差異也較大。筆者測定標準湯劑、3批配方顆粒樣品及飲片原料中山柰素的含量，其中X廠家配方顆粒的整體轉移率高于標準湯劑，但在生產工藝相同條件下，其不同批次產品轉移率仍存在較大差異，提示配方顆粒的質控中原料應是權重最大的因素。本次研究受研究時限和樣本數量限制，結論也不可避免地會有所偏差，因此這些結論尚需收集更大樣本量進行分析和驗證。至于配方顆粒能否代替標準湯劑的臨床應用，仍待進一步的研究。