溫腎活血方對RCS大鼠視網膜變性損傷的保護作用

向圣錦 李佳 竇仁慧 姜小涵 李柏村

視網膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP) 是一組以進行性感光細胞及色素上皮功能喪失為共同表現的遺傳性視網膜變性疾病, 臨床以夜盲、進行性視野損害、眼底特征性改變和視網膜電圖異?；驘o波為其主要臨床特征，是最常見的遺傳性致盲眼病之一[1]，至今未發現確切有效治療RP的方法。中醫藥治療RP有著悠久的歷史，一些藥物臨床與實驗研究均被證實對本病有一定療效[2-3]?，F在中醫學逐漸總結和認識到肝腎陰虛、脾腎陽虛、清陽不升和血瘀脈澀是RP的重要病機[4]。同時我們對歷代治療RP的方劑配伍和臨床用藥規律總結發現，自近代醫家以來，應用溫補腎陽兼活血祛瘀法治療RP的報道亦越來越多[5]。臨證中，我們應用溫腎活血方(熟附子、肉桂、枸杞子、菊花、紅參、丹參等)為主加減治療腎陽不足型RP，獲得不錯的臨床效果。為進一步明確溫腎活血方治療本病的療效機理，本研究以皇家外科學院(royal college surgeons, RCS)大鼠為研究對象，觀察中藥溫腎活血方對RCS大鼠視網膜變性損傷的保護作用，以豐富中藥治療RP的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠購自蘇州昭衍新藥研究中心有限公司，質量合格證號：NO.201910067，SPF級；正常SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，質量合格證號：NO.201614068)；經溫州醫科大學動物倫理委員會批準。RCS大鼠按照4雌2雄進行交配得到純合子胎鼠RCS(rdy-/-,p-/-)24只(雌雄各半)；SD大鼠8只，雌雄各半，鼠齡2周齡。所有大鼠均飼養在湖北中醫藥大學實驗樓動物實驗中心，SPF級動物房飼養，標準顆粒飼料和無菌蒸餾水喂養，自由飲食，室內通風良好，室溫22～25℃；予以12h/12h的晝夜節律，光照時間6：00～18：00，每3～4 d更換一次墊料。

1.2 主要試劑及儀器

補腎活血方(熟附子、肉桂、枸杞子、菊花、紅參、丹參和炙甘草)。上述藥物按原方購買三九制藥有限公司濃縮中藥配方顆粒，按體表換算系數換算后配置成相應濃度后，真空包裝，4℃冰箱保存備用。Tunel凋亡熒光染色試劑盒，普洛麥格(北京)生物技術有限公司；CRM-440切片機，日本SAKURA公司；光學顯微鏡，日本Olympus公司，Axio Observe.Z1全自動倒置熒光光學顯微鏡。無水乙醇、異丙醇、氯仿(北京化學試劑公司)；水合氯醛(國藥集團工業股份有限公司)。

1.3 分組及給藥

24只RCS大鼠按隨機數字表法分為高濃度中藥組、低濃度中藥組和模型組，每組8支，雌雄各半；同時設8支SD大鼠為正常對照組(正常組)。自2周齡開始喂藥：(1)高劑量中藥組、低劑量中藥組予溫腎活血方中藥濃縮顆粒劑灌胃，高劑量中藥組灌胃濃度按中藥濃縮顆粒10.29g/Kg體重計算，低劑量中藥組灌胃濃度按中藥濃縮顆粒3.43g/Kg體重計算，初始灌胃量為0.5ml/次，每日兩次，1周后(出生3周)改為1.0mL，每日1 次。(2) 模型組和正常組：給予0.9%生理鹽水灌胃，方法及頻次同中藥組。3組均于開始治療后28天隨機選取6只大鼠處死，進行相應操作和各個實驗指標測定。

1.4 視網膜組織病理學檢查

水合氯醛麻醉過量處死各組大鼠，快速取出右眼眼球置于4%多聚甲醛中固定48h，然后組織脫水、石蠟包埋，每組隨機選擇3只眼球沿冠狀面行4μm連續切片，蘇木精--伊紅染色(HE染色)后于100倍光學顯微鏡下觀察視網膜各層形態和結構變化并拍照，選取視盤兩側各150μm外外核層細胞核計數，并進行統計學分析。

1.5 TUNEL法檢測感光細胞凋亡

取材時間和方法同上，制作視網膜石蠟包埋切片。按照TUNEL試劑盒說明進行相關檢測。切片DAPI復染后熒光顯微鏡下觀察，自視盤向鋸齒緣方向連續取3個視野，500μm/視野，記錄每個視野中陽性細胞數及感光細胞總數，抽樣6張不同切片，計算平均值，統計感光細胞凋亡率。細胞計數采用3Y-Pixel-PRO 分析軟件，感光細胞凋亡率(%) = 陽性細胞數/感光細胞總數×100%。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠視網膜組織病理學變化

治療后28天，正常組SD大鼠視網膜各層結構完整，外核層感光細胞排列緊密整齊，其外側依次可見感光細胞的內節與外節。模型組大鼠視網膜內核層及外核層均較正常組明顯變薄，細胞排列疏松，欠整齊；外層感光細胞數明顯減少，缺少外節，其余結構基本正常。溫腎活血方高、低濃度組大鼠視網膜內核層及外核層亦較正常組變薄，感光細胞數量減少；但與模型組比較視網膜更厚，感光細胞層數較后者為多，細胞排列也較為整齊(圖1)。細胞計數顯示，空白組、模型組、低劑量中藥組、高劑量中藥組每個高倍視野感光細胞數分別為(205±8)、(52±5)、(75±7)和(120±9)個。統計學分析顯示，模型組大鼠視網膜感光細胞數目較空白組顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.00)，溫腎活血方低濃度中藥組和高濃度中藥組較模型組總體差異有統計學意義(P<0.05)，且高濃度中藥組明顯高于低劑量中藥組(P<0.05)。說明補腎活血方能延緩RCS大鼠視網膜變性，且高濃度中藥顯示出更好的治療效果。

2.2 各組大鼠TUNEL法檢測視網膜感光細胞凋亡情況

治療后28天，正常組大鼠在視網膜外核層(感光細胞層)偶見陽性細胞，但模型組和溫腎活血方不同濃度組大鼠視網膜外核層陽性染色細胞較正常組均明顯增多，出現明顯的細胞凋亡現象(圖2)。模型對照組感光細胞凋亡率為(52.43%±6.22%)，低濃度中藥組為(40.06%±6.64%)，高濃度中藥組(28.94%±6.56%)，三組間比較差異有顯著統計學意義(P<0.05)。兩兩組間比較，溫腎活血方高、低劑量組感光細胞凋亡率明顯低于模型對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。低濃度中藥組、高濃度中藥組間比較差異亦有統計學意義(P<0.05)。

圖1 各組大鼠視網膜組織HE染色

圖2 各組大鼠視網膜組織TUNNEL染色

3 討論

RP屬于中醫學“高風內障”、“高風雀目”、“陰風障”范疇。《目經大成·陰風障》[7]記載本病：“大道行不去，可知世界窄，未晚草堂昏，幾疑天地黑”；《秘傳眼科龍木論·高風雀目內障》[6]中記載其癥狀為“惟見頂上物”。形象地說明了RP以夜盲和逐漸進性視野縮窄為臨床特征?！峨s病源流犀燭?目病源流》[8]曰：“本病亦有生成如此,并由父母遺傳”。這是世界上關于該病具有遺產性的最早記載[4]。目前，中醫學認為本病的發生主要是由于先天稟賦不足所致。或腎陽不足，命門火衰；或肝腎虧損，精血不足；或脾胃虛弱，清陽不升而致[4]。因此，對于本病的治療大多從肝脾腎論治。該病目前沒有可以治療的辦法，大量臨床研究顯示，中藥、針灸以及針藥聯合的中醫藥療法可以部分改善患者視功能，延緩病情進展[2]。

歷代醫家多認識到元陽(腎陽)不足在本病發病中具有重要作用?！赌拷洿蟪伞穂7]認為該病的病機為元陽不足，陽不勝陰所致，曰“至晚不見，曉則復明，蓋元陽不足致病”；“人而陽不勝陰，則氣必下陷，陽氣下陷，則陰氣升騰，縱有火光月色，終不能睹”?！秾徱暚幒穂9]認為該病“蓋元陽不足致病，或曰既陽不足”。《眼科金鏡》[10]認為該病是由于“陽光不足，腎陰虛損所致，乃陽微陰盛”所致。因此，先天稟賦不足，元陽不足，命門火衰；陰陽互根陽虛日久，必損及陰，陰陽俱衰，陰陽不濟，陽氣不能為用。同時，陽虛無以鼓動血行，目中脈絡瘀阻，氣滯血瘀。李傳課教授團隊研究證實RP證候具有虛中夾瘀的特點[11]。因此稟賦不足，命門火衰，陽損及陰，陰陽不濟，終致目中脈絡瘀阻，氣血瘀滯是本病的重要病機[4,8]?，F代臨床研究也證實[12]：RP的發生常合并有視網膜血管進行性閉塞，脈絡膜血管變細。說明該病的發生和目中脈絡瘀阻，氣滯血瘀，目失所養密切相關。腎之陰陽俱損，五臟之精氣不能上承，視衣失其精血榮養，故神光呆滯，夜間昏盲，視界漸窄, 似以管窺物。因此，腎陽不足、并由此導致的目中脈絡淤阻，氣滯血瘀是本病的主要病機，治療當溫腎助陽、補腎填精，兼以益氣活血。而溫腎助陽、補腎填精之重在于溫腎助陽。

溫腎活血方選用大熱之熟附子、肉桂溫補腎陽，枸杞、菊花滋補腎陰、益精明目，陰陽雙補，并可陰中求陽，共補腎中真精元陽，具體較好的補腎明目功效。方中配以紅參大補元氣，以助升陽，丹參活血化瘀通絡；炙甘草調和諸藥。諸藥合之，共奏溫補腎陽、益精明目，補氣活血之功，切中病機?，F代醫學研究發現，紅參能抑制糖尿病大鼠神經節細胞的凋亡，具有神經保護作用[13]。丹參具有改善微循環及血液流變性的作用，其所含的丹參素能增強視網膜血管及視神經纖維的耐缺氧能力，改善缺血缺氧損傷所致的線粒體氧化磷酸化功能障礙，使細胞凋亡和壞死的百分率明顯降低[14]。

RCS大鼠是一種較成熟的視網膜退化性病變動物，因視網膜色素上皮細胞吞噬光感受器細胞外節盤膜能力缺陷，導致大量的盤膜碎片堆積，最終導致光感受器細胞進行性變性和凋亡，是一種常染色體隱性遺傳病，具有人類RP的主要特征，是廣泛用于RP病因及治療方法研究的經典模型鼠[15]。既往研究發現，在出生14天時視網膜結構正常，之后睜眼并接受光線刺激后開始視網膜變性，在出生后28天時，可見視網膜明顯變薄，感光細胞層數減少，外節不規則甚至消失，到42天時視網膜變性進一步加重，56天時則視網膜外層光感細胞完全消失[16]。因此，我們選擇出生后42天進行相關檢測，即在視網膜感光細胞損傷較為嚴重階段，評估溫腎活血方對視網膜感光細胞的保護作用。

本研究結果顯示，RCS大鼠視網膜外核層隨著鼠齡增加視網膜外層逐漸變薄，細胞核排列漸變疏松且數目減少；經不同濃度溫腎活血方治療后，視網膜各層結構排列相對規整，視網膜外層感光細胞層數以及細胞核密度較模型組有不同程度改善，且以較高劑量治療效果更為顯著，說明視網膜形態和結構得到了改善，且以較高劑量濃度改善更為顯著。同時，我們對視網膜組織進行感光細胞凋亡檢測，染色結果顯示凋亡陽性細胞表達程度與外核層變薄的程度具有一致性，且高濃度溫腎活血方較低濃度組更能較少感光細胞凋亡，提示溫腎活血方可以減少RCS大鼠視網膜感光細胞凋亡，對視網膜損傷具有一定保護作用。既往也研究發現，溫陽益氣活血方可以有效抑制RDS小鼠感光細胞的凋亡，保護視網膜外層損傷[3]。結合我們研究結果，進一步說明溫腎活血法在治療視網膜色素變性中具有重要作用。

綜上所述，本研究進一步證實溫腎活血方對遺傳性視網膜色素變性RCS大鼠視網膜感光細胞變性具有一定的保護作用，能夠延緩感光細胞變性和凋亡的進程，但具體的作用機制還有待進一步研究。