DNA條形碼技術(shù)在加工食品鑒定中的應(yīng)用

牛家樂，費(fèi)鑫楊，傅寅旭，張 俊，潘迦明，陳 毓，王 旭

(杭州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053)

近年來，食品安全一直都是備受關(guān)注的熱門話題。全球各國(guó)政府針對(duì)大部分市場(chǎng)流通食品都制定、出臺(tái)了嚴(yán)厲的法律法規(guī)，但在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，仍有部分不法分子通過各種手段進(jìn)行造假摻假[1]。目前，我國(guó)食品安全問題主要體現(xiàn)在加工制作環(huán)節(jié)隱患大，同時(shí)批發(fā)零售和儲(chǔ)藏等環(huán)節(jié)也存在問題[2]。在加工食品的制作過程中，高溫滅菌、煎、炸、添加食品添加劑、食品防腐劑等處理不僅會(huì)改變?cè)牧系男螒B(tài)、味道和口感，還會(huì)造成核基因結(jié)構(gòu)的破壞[3]，這使得加工食品原材料的物種溯源鑒別變得相對(duì)困難。因此，迫切需要建立一些有效的檢測(cè)方法來識(shí)別加工食品的來源，幫助準(zhǔn)確地確定食品摻假造假行為。

目前國(guó)內(nèi)和國(guó)際加工食品及其來源的鑒定方法有：一種是以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢測(cè)法、顯微法、光譜學(xué)、色譜法、質(zhì)譜法等為代表的理化鑒定方法；二是以ELISA、等點(diǎn)聚焦電泳法、人工免疫凝集技術(shù)為代表的傳統(tǒng)生物學(xué)鑒定方法[4]；第三種是以PCR技術(shù)、AFLP技術(shù)、DNA條形碼技術(shù)為代表的現(xiàn)代分子檢測(cè)技術(shù)[5]。相比之下，由于加工后食品的外觀相似，傳統(tǒng)的理化方法具有較高的假陽性率。傳統(tǒng)的生物學(xué)鑒定方法也因性價(jià)比低、特異性差、靈敏度低等而存在局限性[6]。隨著生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷更新建立，基于DNA檢測(cè)的現(xiàn)代分子檢測(cè)技術(shù)憑借DNA樣本的穩(wěn)定性和廣泛性在加工食品的檢測(cè)中發(fā)揮著相對(duì)重要的作用[7]。在各種現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)中，DNA條形碼(DNA barcoding)被認(rèn)為是一種基于分子生物學(xué)手段鑒定生物標(biāo)本的技術(shù)，可以有效地鑒別原材料來源，以及工業(yè)食品鏈中出現(xiàn)的摻假現(xiàn)象[8-9]。因此，DNA條形碼技術(shù)在加工食品鑒定的實(shí)際應(yīng)用中具有廣闊的前景。

1 DNA條形碼概述

1.1 DNA條形碼定義

DNA條形碼技術(shù)最早由加拿大動(dòng)物分類學(xué)家Paul Hebert在2003年提出，其理論依據(jù)是使用一段獨(dú)立物種的特定DNA序列，對(duì)該基因區(qū)段設(shè)計(jì)通用引物，并通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序?qū)⑿蛄信c現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，確定物種名稱和生物實(shí)體之間對(duì)應(yīng)的關(guān)系[10]。該方法類似于超市商品由條形掃碼確定，并且利用A、T、G、C四個(gè)堿基的基因順序識(shí)別物種，每個(gè)物種都能找到與其特異對(duì)應(yīng)的DNA條形碼序列。這種基于遺傳信息的DNA條形碼技術(shù)對(duì)已知和未知物種的鑒定使其在食品檢測(cè)等領(lǐng)域發(fā)展迅速。

1.2 DNA條形碼的優(yōu)點(diǎn)

DNA條形碼作為一種在食品鑒定領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景的分子技術(shù)，具有以下優(yōu)勢(shì)：(1) DNA序列是物種鑒別的金標(biāo)準(zhǔn)：它基于遺傳信息，不受個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育和外部環(huán)境的影響；(2) 公認(rèn)的國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)信息：2003年，全球50多個(gè)國(guó)家的研究機(jī)構(gòu)提出國(guó)際生命條形碼計(jì)劃(International Barcode of Life,IBOL)以實(shí)現(xiàn)DNA條形碼用于物種鑒定的全球化標(biāo)準(zhǔn)。2010年，成功建立了昆蟲、魚類和鳥類等動(dòng)物物種的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)[11-13]，以及入侵生物和害蟲DNA條形碼信息庫(kù)(INBIPS)、生命DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)(Barcode of Life Database,BLOD)[14]；(3) 通用引物的設(shè)計(jì)：通過特定分子技術(shù)(例如實(shí)時(shí)熒光定量PCR等)鑒定多個(gè)物種通常需要整合幾對(duì)或甚至幾十種引物探針，而DNA條形碼只需要一對(duì)或幾對(duì)引物即可達(dá)到預(yù)期的效果[15]；(4) 未知物種的發(fā)現(xiàn)和鑒別：對(duì)發(fā)現(xiàn)的未知物種，通過計(jì)算遺傳距離、數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)以及構(gòu)建進(jìn)化樹，實(shí)現(xiàn)物種的識(shí)別和定位[16]。

目前，動(dòng)物DNA的數(shù)據(jù)庫(kù)主要包括生命DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)(BOLD)、魚類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)(FBIS)和美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，用于管理植物DNA的數(shù)據(jù)庫(kù)包括NCBI、歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(TMBL)和日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)，以上系統(tǒng)均以DNA條形碼為通用標(biāo)準(zhǔn)，并提供一個(gè)聯(lián)機(jī)工作臺(tái)，用于收集、管理、分析和使用DNA條形碼。其中動(dòng)物DNA條形碼技術(shù)通常使用680 bp的線粒體CO I(Cytochrome C oxidase subunit I,CO I)序列作為靶標(biāo)[17]，植物DNA條形碼的靶標(biāo)是國(guó)際生命條形碼聯(lián)盟植物工作組(Consortium for the Barcode of Life Plant Working Group)在2009年初步確定并推薦使用的葉綠體基因編碼區(qū)(rbcL和matK)、間隔區(qū)(trnH-psbA)及核基因ITS[18]。隨著DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善和DNA條形碼技術(shù)的不斷發(fā)展，國(guó)內(nèi)外的許多專家學(xué)者對(duì)食品安全領(lǐng)域的摻假問題以及錯(cuò)貼標(biāo)簽等問題進(jìn)行了深入的探究[19]。研究表明，DNA條形碼技術(shù)可以避免形態(tài)學(xué)分類的缺陷，打破傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)中PCR檢測(cè)目標(biāo)唯一性的局限，具有更廣闊的應(yīng)用前景。

2 DNA條形碼技術(shù)在加工食品鑒定中的應(yīng)用

隨著食品全球化的發(fā)展和人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的需求，市場(chǎng)上加工食品數(shù)量和種類越來越多，但這也意味著替代類似物種和不受控制地添加外來物種將對(duì)消費(fèi)者的健康構(gòu)成重大風(fēng)險(xiǎn)。采用常規(guī)理化技術(shù)或DNA芯片等傳統(tǒng)分子水平的鑒定技術(shù)，在加工食品鑒定中受到限制。目前，DNA條形碼技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物和微生物等領(lǐng)域[20-24]。作為一種簡(jiǎn)便而精確的鑒定方法，新興的DNA條形碼技術(shù)為加工食品的分類鑒定以及標(biāo)簽的合規(guī)性也提供了新的方向，在加工食品檢測(cè)中的應(yīng)用越來越廣泛[25]。

2.1 DNA條形碼技術(shù)在畜禽肉制品鑒定中的應(yīng)用

在人類日常消費(fèi)中，以家畜、家禽為主的肉及其加工制品的食用占比很高。由于商家對(duì)原材料進(jìn)行了加工，使得消費(fèi)者無法對(duì)肉質(zhì)進(jìn)行識(shí)別，只有通過技術(shù)手段才能進(jìn)行鑒別，而DNA條形碼技術(shù)因其特異性強(qiáng)、檢出率高等優(yōu)勢(shì)而被廣泛使用[26]。鐘文濤等[27]利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)市售的50份牛羊肉制品的動(dòng)物成分進(jìn)行了抽查，結(jié)果表明，牛肉丸的摻假率高達(dá)50%，烤牛肉串和烤羊肉串摻假率分別為36.4%和35.7%。Quinto等[28]利用線粒體CO I基因?yàn)榘袠?biāo)，對(duì)美國(guó)54份野生動(dòng)物肉制品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)18.5%的商品存在虛假標(biāo)簽的問題。上述研究證明了DNA條形碼技術(shù)在動(dòng)物肉制品鑒定中的有效性。

2.2 DNA條形碼技術(shù)在植物、動(dòng)物源中藥產(chǎn)品鑒定中的應(yīng)用

中國(guó)已經(jīng)確定的藥用植物超過11000種，藥材市場(chǎng)上魚目混珠的現(xiàn)象有很多。劉沖[31]等建立的阿魏藥材DNA條形碼ITS2序列鑒別方法可準(zhǔn)確、快速地鑒別出阿魏屬藥材的正品和混淆品。張立秋[32]等對(duì)白頭翁、朝鮮白頭翁、興安白頭翁3種藥用植物和藥材進(jìn)行了形態(tài)分類和ITS2序列分子鑒別研究，為建立其分子鑒定方法提供有力依據(jù)。另外，杜鶴等[29]基于DNA條形碼技術(shù)對(duì)14份市售鹿茸及其混偽品進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果為鹿茸的鑒別提供了新的可行性方法。張紅印等[30]利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)蜈蚣藥材及其混偽品共50份樣品進(jìn)行鑒別，為蜈蚣藥材鑒定提供新的方法。以上研究利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)中藥產(chǎn)品進(jìn)行鑒定，為保障臨床用藥安全和市場(chǎng)監(jiān)管提供了新的技術(shù)手段。

2.4 DNA條形碼技術(shù)在海產(chǎn)品鑒定中的應(yīng)用

DNA條形碼技術(shù)在海產(chǎn)品原料的可追溯性方面也特別有效[33]。Maralita等[34]利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)菲律賓市場(chǎng)上貼有標(biāo)簽的海產(chǎn)品進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)冷凍的沙丁魚和金槍魚魚片有錯(cuò)帖標(biāo)簽現(xiàn)象，并且還發(fā)現(xiàn)一種標(biāo)簽為gindara的魚排中含有對(duì)人類身體健康有害的魚類。Chin等[35]運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)調(diào)味魚罐頭、魚球爆米花及蟹餃等形式的共54種加工海產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)16%的樣本有錯(cuò)帖標(biāo)簽現(xiàn)象。這些研究證明DNA條形碼技術(shù)可以成為海鮮產(chǎn)品來源證明的有力工具，也為商業(yè)漁類產(chǎn)品的物種識(shí)別和真實(shí)性測(cè)試提供了一種強(qiáng)有力的評(píng)估方法。此外，為進(jìn)一步提高DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用性，Rasmussen等[36]提出了更為經(jīng)濟(jì)的微型DNA條形碼(mini DNA barcodes)技術(shù)，該技術(shù)可以有效地對(duì)經(jīng)深加工并且DNA已經(jīng)大量降解的食品進(jìn)行鑒定[37]。隨著近幾年來mini-DNA條形碼技術(shù)在海產(chǎn)品鑒定中的不斷深入運(yùn)用，Xiong等[38]運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)及mini-DNA條形碼技術(shù)發(fā)現(xiàn)中國(guó)市場(chǎng)上的烤鱈魚片產(chǎn)品有58%存在錯(cuò)貼標(biāo)簽的現(xiàn)象，并且得出mini-DNA條形碼技術(shù)相較普通DNA條形碼技術(shù)更為敏感的結(jié)論。

3 小結(jié)

食品安全是國(guó)內(nèi)外密切關(guān)注的熱點(diǎn)。全球貿(mào)易談判要求食品在準(zhǔn)確的標(biāo)簽和物種可追溯性方面進(jìn)行嚴(yán)格的認(rèn)證。因此，各國(guó)貿(mào)易政策應(yīng)符合這些要求，要確保食品安全性和可持續(xù)性[39]。但是，如果沒有強(qiáng)有力的監(jiān)測(cè)戰(zhàn)略和實(shí)施基礎(chǔ)，很難實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。DNA條形碼技術(shù)是物種分類的有效工具，并且在食品錯(cuò)帖標(biāo)簽和原料追溯性方面發(fā)揮著重要作用。但是，該技術(shù)仍存在一些困難和挑戰(zhàn)：首先，該技術(shù)依賴參考的數(shù)據(jù)庫(kù)創(chuàng)建不夠完善會(huì)導(dǎo)致許多不確定因素；其次，許多食品的原料來源具有相似基因圖譜，線粒體多態(tài)性和線粒體DNA修復(fù)機(jī)制也會(huì)給鑒定帶來一定困難[40-42]，此外，該技術(shù)還存在不能區(qū)分樣本的地理來源和不能準(zhǔn)確鑒定雜交物種種屬信息[43]等缺點(diǎn)。

綜上所述，盡管DNA條形碼技術(shù)仍存在一些問題，但與常見的形態(tài)及理化分析鑒別方法，以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR、SNP等檢測(cè)方法相比，DNA條形碼技術(shù)的分類覆蓋率高、檢測(cè)高通量等優(yōu)勢(shì)使其成為一項(xiàng)越來越適用的分子診斷技術(shù)[44]。隨著DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的進(jìn)一步完善，DNA條形碼技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的鑒定能力將會(huì)得到不斷的強(qiáng)化。隨著越來越多的DNA條形碼引物被設(shè)計(jì)和完善，標(biāo)本鑒定過程可以在較短時(shí)間內(nèi)建立并形成易于利用且穩(wěn)定的系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)字化[40]，這也將對(duì)食品安全監(jiān)督領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的影響[43]。