藍玉簪龍膽提取物在護膚品中的應用

耿曉玲，李崇正，次旺嘎旦，谷禮民

(江陰職業技術學院 環境與材料工程系，江蘇 江陰 214433)

近年來，天然植物中的活性成分被廣泛地應用于食品、藥品、化妝品等領域，各類植物提取成分主打的化妝品都被逐步推向了國際市場，尤其是中草藥類護膚產品在市場上廣受好評。我國植物資源豐富，植物成分提取方法簡便易行，添加后制得的相應產品療效顯著，毒副作用小，在國內的化妝品研發領域備受關注[1-2]。

藏藥“龍膽花”，藏藥名“榜間”，為龍膽科龍膽屬多種植物的花，主要分布于西藏、甘肅等地，常以單味或復方入藥[3]。目前，國內外對藍花龍膽的研究報道較少，現有的報道主要是針對藍花龍膽中活性成分的分離鑒定等方面。李珊等[4]對藍玉簪龍膽地上部分中的黃酮苷類化學成分進行了分析，得到了6個黃酮苷類化合物。楊紅澎等[5]通過色譜技術進行分離，利用質譜、核磁共振等波譜技術鑒定化合物的結構，從藍玉簪龍膽的花中分離得到5個苷類成分。劉菁菁等[6]研究發現藍玉簪龍膽提取物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)均具有一定的抗菌作用，對MRSA感染小鼠也有一定治療作用。侯穎[7]等發現藍玉簪顆?？稍鰪姍C體抗氧化酶的活力，調節氧化，抗氧化平衡。目前，對藍花龍膽應用于天然護膚品領域的報道還沒有，本文將在藍花龍膽提取物體外抗菌的基礎上，將其應用于保濕水和潤膚乳兩種體系中，進行龍膽提取物的配伍性測試和抗菌測試，為藍花龍膽開發更廣闊的應用前景。

1 實驗儀器與材料

1.1 主要儀器

PHS-3C型酸度計，上海大普儀器有限公司；STSJB-120電動攪拌器，鄭州長城科工貿有限公司。SZF7-200粉碎機，天津市泰析特儀器有限公司；XMTD-8222真空干燥箱，國華電器有限公司；RE-52CS旋轉蒸發器，上海振捷實驗設備有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；721分光光度計，上海現科分光儀器有限公司；VS-840/1300超凈工作臺，蘇州長留凈化科技有限公司等。

1.2 主要試劑與材料

本實驗使用的氫氧化鈉、硼砂、無水乙醇、透明質酸鈉、聚氧乙烯(n=20)失水山梨醇硬脂酸酯、失水山梨醇單硬脂酸酯、丙二醇、甘油等均為分析純。瓊脂、蛋白胨、牛肉浸膏等均為生化試劑，以上試劑均購于北京國藥集團化學試劑有限公司。

藍花龍膽花購于西藏山南市錯那縣，金黃色色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉菌均為純菌株，購于南京微生物分析檢測中心。

2 實驗方法

2.1 藍花龍膽提取物的制備工藝

將藍花龍膽進行預處理，洗凈烘干粉碎，過40目篩分，得到粉末狀樣品。稱取50g預處理后的龍膽花樣品，70%乙醇作為溶劑，按照液料比6∶1(mL：g)加入裝有樣品的容器中，加熱攪拌回流 4h后過濾。繼續用相同濃度的乙醇溶液洗滌，再次過濾，合并濾液，低溫離心，取上層澄清液，真空濃縮后待用。折算為干物質,將得到的濃縮物冷藏備用。

2.2 藍花龍膽提取物抗菌特性的檢測方法[8]

2.2.1 牛津杯法

供試菌株：大腸桿菌、金黃葡萄桿菌和黑曲霉菌。

用蒸餾水調整提取物的濃度，得到含量分別為1g龍膽花干品/10mL、1g龍膽花干品/5mL、1g龍膽花干品/1mL的濃縮液待用。按標準配置固體培養基，高壓滅菌，制平板。將活化后的大腸桿菌、金黃葡萄桿菌稀釋至濃度為1.0×10-7cfu/mL，黑曲霉菌的濃度為1.0×10-6cfu/mL，均勻涂布，將牛津杯放置于平板上。分別取200μL稀釋后的提取液樣品加入牛津杯中。分別做3個平行實驗。將培養皿蓋好放置在生化培養箱內，細菌培養溫度 37.5℃，真菌培養溫度 28℃。觀察以上菌株生長情況及測量抑菌圈直徑。

2.2.2 MIC的測定[8]

本實驗采用液體稀釋法測各提取物對上述菌株測定最小抑菌濃度。將各菌株接種至固體培養基上,37 ℃恒溫培養24h 后, 用生理鹽水將菌落洗下。用比濁管對比稀釋后4 ℃儲存備用。以測定抑菌圈實驗中用的 1.0mg/mL 的提取液作為原液。參考文獻[8]中的方法，配制相應的菌液濃度為105cfu/m L，稀釋原液濃度，使最終濃度為：80.0%、70.0%、60.0%、30.0%、10.0%、5.0%。以相應的溶劑做空白對照。細菌培養條件為，37℃搖床培養 24h，真菌培養條件為28℃搖床培養 24h 后。分別取 20μL 菌液涂板培養并于 24h 后觀察菌種生長情況。

2.3 保濕水基礎配方

保濕水基礎配方見表1～表3。

表1 保濕水基礎配方A部分

表2 保濕水基礎配方B部分

表3 保濕水基礎配方C部分

2.4 保濕水配制工藝

將A部分水加入主鍋，然后將卡波姆慢慢撒入分散均勻，然后將透明質酸鈉、丙二醇預先混合攪拌后加入水相，再將部分剩下所有原料加入水相，攪拌分散均勻，加熱至80-85℃。B部分待完全溶解均勻后開始降溫，待溫度降到50℃時，加入B01，攪拌均勻。將C部分三個組分在不銹鋼容器中預先混合，攪拌至完全透明，待溫度降至40～45℃時，加入主鍋。加入上述全部原料后，加入一定量的藍花龍膽提取物，余量用水補充，攪拌均勻后出料。

2.5 潤膚乳基礎配方

潤膚乳基礎配方見表4。

表4 潤膚乳基礎配方

2.6 潤膚乳配制工藝

水相中卡波加入水中，加熱攪拌至溶解完全。水相剩余料體預混合之后加入水中，加熱至80℃。B相原料混合之后加熱到80℃，加入水相中，均質5min。降溫至60℃加入預混合的C相，之后加入龍膽提取物相原料低速攪拌。出料待用。

2.7 檢測方法

保濕水的檢測指標劑檢測方法參見 GB/T2660。

潤膚乳的檢測指標劑檢測方法參見 GB/T29665-2013。

2.8 抗菌物質(龍膽花提取物)與化妝品基礎配方的配伍性

依據2.2.2中測得的最低抑菌濃度數據，微調后添加到保濕水和潤膚乳的基礎配方中， 3個月后參照標準進行觀察、評價。

2.9 龍膽花提取物在化妝品體系中的抗菌性能[9]

化妝品常規防腐劑體系有水劑體系和乳霜體系。其中水劑型的配方：尼泊金甲酯 0.17%,DMDM 乙內酰尿0.2%。乳霜型的配方：尼泊金甲酯 0.2%，尼泊金丙酯 0.15%，DMDM 乙內酰尿 0.2%。

本實驗按照上述體系，選用尼泊金甲酯作為陽性參照。進行抑菌圈實驗，具體參考2.2.1具體方法，將牛津杯改成同直徑紙片做試樣。

3 實驗結果

3.1 牛津杯法測定龍膽提取物抗菌特性

表5 抑菌圈直徑

選取金黃色葡萄球菌(G+)、埃希氏大腸桿菌(G-)，常見腸道致病菌)、真菌黑曲霉為供試菌株，根據瓊脂擴散法程度測定抑菌圈大小。在操作中，需要保證加注底層的培養基厚度均勻，否則容易出現重現性差等異常情況，主要是由于瓊脂層的厚度與抑菌物質的擴散速度密切相關，因此抑菌試驗的每一步都需要仔細謹慎，嚴格按照操作規范，才可以得到準確的檢測結果。

從表5可以看出，龍膽花提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有一定的抑菌作用，抑菌圈大小分別為 17.9mm，12.4mm。黑曲霉的抑菌圈較小，為7.1mm，抑菌效果不顯著。

圖1 抑菌圈直徑對照圖

比較各菌株對提取物敏感性的大小可以發現：金黃色葡萄球菌>大腸桿菌桿菌而龍膽花提取物對霉菌黑曲霉幾乎沒有抑菌作用。

3.2 MIC的確定

表6 各菌株的最小抑制濃度

注：“-”表示無菌生長；“+”表示有菌生長，“+”越多代表菌體長的越密。

測得龍膽花提物最低抑菌濃度如表6，比較各樣品試管與對照試管，可以明顯看出試管內肉湯培養基的渾濁度，隨著提物濃度的增加，抑菌活性也增加，龍膽花提取物對各菌株的最低抑菌濃度分別為：金黃色葡萄球菌60%，大腸桿菌為70%，對黑曲霉抑制作用很小。其中金黃色葡萄球菌對提取物最為敏感。

3.3 配伍性測試結果

按照2.7、2.8中方法進行測試，90天后進行評價，結果如下：

由表7可見，添加天然抗菌物質龍膽花提取物會使化妝品顏色變化，呈現出微黃色，且隨著溫度的升高，顏色有所加深，但是不顯著。龍膽花提取物屬于水溶性物質，可以應用于水劑體系，乳液體系。 與化妝品常規體系配伍性較好，可以運用到化妝品常規體系中。

表7 龍膽花提取物與基礎原料的配伍性測試

3.4 龍膽花提取物抑菌活性成分在化妝品體系中的抑菌作用

表8 抑菌成分在保濕水中的抑菌性 (抑菌圈直徑單位：mm)

表9 抑菌成分在潤膚霜中的抑菌性 (抑菌圈直徑單位：mm)

從表8、表9可以得出以下結論：

對于本實驗的兩個化妝品基礎體系(水，乳)，在本實驗操作條件下，空白培養基對其沒有抑菌作用，可以排除培養基和外界環境對抑菌效果的干擾。龍膽提取物和尼泊金甲酯陽性對照組對 2種細菌菌均有明顯的抑制作用，后者對真菌也抑制效果較好，藍花龍膽提取物幾乎對黑曲霉無抑制。藍花龍膽提取物在保濕水、潤膚乳中對金黃色葡萄球菌抑菌效果較為明顯，大腸桿菌次之。兩種細菌在乳劑體系中的受抑制的效果要優于水劑體系，藍花龍膽提取物在這兩種不同體系產品中的抑菌圈直徑最低都超過了7mm，說明提取物對這兩種劑型的化妝品都有一定的抑制能力，但是與很多天然提取物一樣，龍膽提取物的抑菌效果與尼泊金甲酯相比，抑菌效果要弱得多，尤其是對黑曲霉。以上結果表明，藍花龍膽提取物可以作為防腐增效劑用于抑制化妝品中特定的微生物菌群，但是如何增強其抑菌活力，還有待進一步研究。

4 結論

隨著人們生活水平的提高和對化妝品認識的加深，化妝品安全意識更加強烈。尋找更加安全有效的天然植物來源防腐劑越來越迫切。本文采用醇提法提取了西藏藍花龍膽中的活性物質，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉為供試菌株，進行抑菌活性試驗。結果表明龍膽花提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有一定的抑菌作用，而對真菌黑曲霉的抑菌性不顯著，其中金黃色葡萄球菌對提取物最為敏感。通過配制保濕水和潤膚乳，進行龍膽提取物的配伍性測試和抗菌測試，發現添加天然抗菌物質龍膽花提取物會使化妝品顏色變化，呈現出微黃色，且隨著溫度的升高，顏色有所加深，但是不顯著。龍膽花提取物可以應用于水劑體系，乳液體系， 與化妝品常規體系配伍性較好，可以運用到化妝品常規體系中。