特發性視神經炎動物模型的研究進展

黃寶輝 戰家霖綜述 杜 毅審校

(1 廣西百色市人民醫院眼科，百色市 533000；2 廣西醫科大學第一附屬醫院眼科，南寧市 530021)

【提要】 多發性硬化相關性視神經炎(MS-ON)和視神經脊髓炎相關性視神經炎(NMO-ON)是人類特發性視神經炎最常見的類型，在中青年人群中成為主要的致盲性視神經疾病之一。目前其病因尚未明確，動物模型的建立對于進一步研究發病機制及開發有效藥物至關重要。現對相關的特發性視神經炎動物模型的研究進展作一綜述。

特發性視神經炎(idiopathic demyelinating optic neuritis，IDON)是指發生在視神經的脫髓鞘病變，是中青年人群最主要的致盲性視神經疾病之一。其中最常見的兩種類型為多發性硬化相關性視神經炎(multiple sclerosis related optic neuritis，MS-ON)和視神經脊髓炎相關性視神經炎(neuromyelitis optica related optic neuritis，NMO-ON)。由于IDON的病因未明，建立有效的動物模型將有助于我們認識疾病的發生發展規律，進一步探索MS-ON和NMO-ON的發病機制及尋找新的治療方法。目前相關動物模型眾多，據此，本文對常見的MS-ON動物模型和NMO-ON動物模型作一綜述。

1 多發性硬化相關性視神經炎動物實驗模型

MS-ON亦稱特發性脫髓鞘性視神經炎，通常是多發性硬化等自身免疫脫髓鞘疾病的第一征兆[1]，在高加索人群和高度工業化人群中多見[2]，是歐美國家研究報道中最主要的視神經炎類型。目前相關模型包括自身免疫誘導的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型、病毒誘導模型和毒素誘導模型[3-4]，其中EAE模型是目前用于研究MS-ON最常用的模型。

1.1 EAE模型 Rivers等[5]1935年首先提出了向猴子大腦注入兔腦提取物，表現出的神經損害與腦脊髓炎的組織學損害相似，其中包括血管周圍炎性改變以及脫髓鞘，后亦稱為EAE，是建立的第一個EAE模型。EAE模型與多發性硬化臨床表現和病理學特征相似，經過幾十年研究發現，EAE充分闡明視神經在MS期間發生的病理過程，即視神經伴隨腦和脊髓發生中樞神經系統(CNS)炎癥、脫髓鞘、軸突喪失和神經膠質增生[3，6-7]。因此，EAE模型是研究MS-ON的重要動物模型。

目前已經通過多種方法誘導易感實驗動物進行免疫，包括用純化的蛋白質或衍生肽，如髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)、髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)、髓鞘蛋白脂質蛋白(myelin proteolipid protein，PLP)或其他髓磷脂蛋白質建立主動EAE模型[6，8]。疾病誘導通常需要免疫佐劑，例如補充有熱滅活結核分枝桿菌的完全弗氏佐劑(complete Freund′s adjuvant，CFA)以充當抗原貯庫[9]。大多數EAE誘導方案需要使用百日咳毒素(pertussis，PT)[10]，盡管百日咳毒素在EAE中的確切作用尚不清楚，但認為其在免疫細胞進入中樞神經系統的過程中起到一定作用，促進T細胞的增殖和細胞因子的產生，以及破壞T細胞的耐受性[11]。

1.1.1 嚙齒類動物EAE模型 EAE是一種獨特的疾病，其每種形式只表現MS的某些方面特征。誘導方案取決于動物的易感性、年齡和性別。其中，大鼠對EAE敏感性高,是國外早期研究報道中常見的品系[12]。而根據近年來研究報道，EAE嚙齒動物模型在中樞神經系統自身免疫性炎癥研究中占主導地位，目前常見EAE模型見表1。

表1 常見的幾種EAE模型比較

以上幾種類型中，MOG誘導EAE模型在動物實驗研究中已成為首選[4]。其優點在于：(1)建模成功率高[17]。(2)在病理和臨床表現方面，MOG誘導C57BL/6小鼠的EAE模型最接近人類的MS[18]。(3)由MOG誘導的EAE模型與T細胞反應和嚴重的脫髓鞘相關，而主要的髓鞘成分(如MBP和PLP)誘導的疾病特征是嚴重的炎癥，很少或沒有脫髓鞘[4]。因此，由MOG誘導的EAE模型可以從T細胞和B細胞的效應機制以及脫髓鞘作用的角度闡明MS(包括MS-ON)的發病機制，這與MS目前的研究方向是一致的。(4)C57BL/6J小鼠的維持成本低，遺傳背景清楚，基因操作容易[19]，可滿足深入研究基因、細胞間作用等領域的需求。

1.1.2 非人類靈長動物EAE模型 目前使用最多的非人類靈長動物(non-human primates，NHP)是常見的Mar猴。用CFA和百日咳乳化的MOG誘導Mar猴建立EAE模型，產生慢性復發-緩解過程，特征是炎性浸潤和大量脫髓鞘，嚴重的白質損害和神經變性[3]。優點為NHP是人類系統發育上最親近的近屬[8]，可能會重現與人類相似的免疫反應。嚙齒類動物 EAE模型已經幫助我們理解免疫致病機制的大部分內容，然而，在我們將嚙齒類動物 EAE模型中的研究成果轉化為有效的治療方法的過程中遇到了困難，NHP模型可能會幫助我們解決這個問題。缺點是NHP價格昂貴，因此在研究報道中并不常見。

1.1.3 被動EAE模型 被動EAE模型是通過主動免疫后轉移供體動物中產生的致病性的髓鞘特異性T細胞[20]，并在受體動物中誘導的一種EAE模型。雖然主動免疫通常是研究EAE模型的首選方案，但被動EAE模型通過髓鞘特異性T細胞靶向組織，有助于確定髓鞘反應性T細胞在疾病發病機制中的關鍵作用，明確各種炎癥分子的反應過程。

1.2 病毒誘導模型和毒素誘導模型 泰勒氏病毒、犬瘟熱病毒和小鼠肝炎病毒等病毒可誘導脫髓鞘動物模型[21]。其中常見的是泰勒氏小鼠腦脊髓炎病毒(Theiler′s murine encephalomyelitis virus，TMEV)誘導的慢性脫髓鞘模型，但是這種模型的缺點是耗費時間，且脫髓鞘和髓鞘再生同時發生[3]。銅宗、溴化乙錠、溶血卵磷脂等毒素也可誘導脫髓鞘動物模型。溴化乙錠對所有有核細胞具有毒性作用，可以通過立體定向注射溴化乙錠產生局灶性脫髓鞘病變。例如，在注射到蛛網膜下腔后產生視神經炎[22]。該模型的優點是定向注射易于觀察注射部位的脫髓鞘情況，并可確定病毒量和病變大小的關系。病毒和毒素誘導脫髓鞘模型，有助于研究髓鞘再生，但隨著研究的深入，發現此類脫髓鞘和MS的特點有差異，所以使用較少。

2 視神經脊髓炎相關性視神經炎動物實驗模型

特異性抗體 NMO-IgG的發現[23]，證實了NMO-ON區別于MS-ON。Bradl等[24]首次通過將NMO-IgG注射到健康嚙齒動物的腹腔來誘導實驗性NMO，導致實驗動物血清NMO-IgG陽性，但未能造成CNS損傷。隨后發現，在實驗性自身免疫性腦脊髓炎的情況下，NMO-IgG可加重炎癥并調節免疫應答[25]。因此，破壞或繞過血腦屏障是目前設計NMO動物模型的主要方法。

2.1 EAE為基礎的NMO模型(NMO/EAE)

2.1.1 主動NMO/EAE模型 通過用完全弗氏佐劑乳化MBP免疫激活CNS抗原特異性T細胞誘導Lewis大鼠，建立主動NMO/EAE模型，當Lewis大鼠開始出現中樞神經系統炎癥癥狀(即體重減輕或輕微的神經癥狀，如尾部張力喪失)后，血腦屏障處于開放狀態，促進血清蛋白進入中樞神經系統實質。隨后，大鼠在EAE疾病的高峰處接受來自NMO-IgG血清陽性患者的純化IgG的腹膜內注射， NMO/EAE病理表現出損傷部位中性粒細胞的大量浸潤，以及血管周圍補體沉積和星形膠質細胞的嚴重損失，后期可觀察到明顯脫髓鞘和繼發性少突膠質細胞破壞[26]。雖然T淋巴細胞和巨噬細胞的浸潤導致EAE模型表現出癱瘓，但髓鞘或軸突通常沒有病理學改變，因此，引發的神經病理損傷可歸因于注入的患者IgG[25]。

NMO/EAE模型是目前研究NMO疾病發展的合適模型。但該模型也面臨一些問題：(1)需要的來自患者的NMO-IgG數量有限。由于個體因素和疾病進程差異，NMO-IgG一致性和致病效力因人而異，一些患者的NMO-IgG在體內無效[27]，而克隆性NMO-IgG可能涉及致病效力下降的問題。(2)Lewis大鼠的NMO/EAE模型是Th1細胞驅動的CNS疾病，而在NMO患者中，已發現水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)特異性T細胞表現出由Th17細胞驅動的疾病過程[28]。雖然小鼠顯示出這種Th17偏倚[29]，但由于人NMO-IgG只能結合和激活大鼠補體[24，30]，所以小鼠目前不能用于免疫誘導的NMO/EAE模型。

2.1.2 被動NMO/EAE模型 Bradl等[24]建立了將體外活化的CNS抗原特異性T細胞過繼轉移的NMO/EAE被動模型。從免疫大鼠收獲的髓磷脂反應性T細胞在體外重復刺激復制擴增，將這些細胞注入正常大鼠，誘導NMO樣病變，出現包括補體激活、免疫球蛋白沉積、脊髓血管周圍粒細胞浸潤以及AQP4和星形膠質細胞丟失等情況。這類模型具有多種相似病理特征，可以研究髓磷脂反應性T細胞在疾病發病機制中的關鍵作用，但缺乏髓鞘損傷是其重要的局限性[31]。

值得注意的是，在NMO/EAE被動模型中，特異性T細胞可能不是必不可少的。用完全佐劑(CFA)單獨誘導，破壞血腦屏障，雖然導致T細胞浸潤范圍較小并且只表現出較弱的致病性，但通過NMO-IgG的被動轉移足以促進病變發展[27]。Graber等[32]提到其中的原因可能是分枝桿菌表達與AQP4具有序列同源性的蛋白質，使用CFA的免疫誘導可以激活特異性T細胞應答。

2.2 直接注射NMO-IgG和補體或細胞因子的NMO模型 Matsumoto等[33]首次將NMO-IgG陽性患者的血清定位注射到SD大鼠視神經鞘內，表現出大鼠視神經AQP4和GFAP的損失，視神經纖維的損失和炎癥細胞浸潤及與人類NMO病變類似的組織學特征。Asavapanumas等[34]將NMO-IgG陽性患者NMO-IgG和補體共同定位注射到小鼠視交叉，可產生NMO樣視神經病變。NMO-IgG和補體共同注射模型的優點是直接注入未免疫動物的CNS，有助于研究NMO-IgG結合的直接作用，而且該模型比NMO/EAE模型需要更少的NMO-IgG。除此之外，相對于NMO/EAE模型受大鼠的局限，這種模型可以應用于小鼠，包括轉基因小鼠，因而對分子層面的認識也將進一步加深。該模型存在的問題[26]：(1)鼠補體不能被NMO-IgG結合和激活，需要共同注射人補體，這可能會忽略天然嚙齒動物補體抑制成分的作用，與人體環境有差異；(2)需要在多個部位和一定體積范圍中重復注射，這可能改變CNS對人為干預的炎性刺激的易感性。

2.3 其他NMO模型 還有一類不涉及NMO-IgG或AQP4的模型，在視神經和脊髓表現出類似于NMO的組織病理學變化，可作為研究NMO-ON某些方面的動物模型的補充。Bettelli等[35]和Krishnamoorthy等[36]將攜帶直接針對MOG35-55的T細胞的轉基因小鼠，與具有針對MOG的B細胞受體的轉基因小鼠雜交，建立“2D2”EAE模型，這些雙轉基因存在于C57BL/6小鼠的遺傳背景上，子代自發發展為與NMO患者相似的視神經炎和嚴重的脊髓損傷，表現為病變部位的AQP4蛋白減少和脫髓鞘。然而，與人NMO病理不同的是，在該模型中沒有找到補體沉積或粒細胞募集的證據[25，31]。

目前已有的模型極大地加深了我們對特發性視神經炎的認識，但是尚有局限性，沒有一種模型能夠完全模擬MS-ON或NMO-ON的病理生理學特征。因此，在未來的研究工作中，我們期待更完善的動物模型出現，并且可以通過主動免疫模型和被動轉移以及直接注射等多種結合的方式，以幫助進一步了解特發性視神經炎的發病機制，并進行藥物研發。