小檗堿與多種成分復配及其對番茄灰霉病的抑制作用

李朋鈺 李映 楊濤 田平芳 田國英 葛喜珍

摘要：采用菌絲生長速率法和共毒因子法，測定小檗堿與山豆根、爐甘石、蕓薹素內酯、復硝酚鈉復配劑對番茄灰霉病的抑制作用。結果表明，小檗堿（0.280 mg/mL）與10%山豆根（2.257 mg/mL）、小檗堿（0.155 5 mg/mL）與爐甘石（0.062 5 mg/mL）復配使用對灰霉病菌抑制效果較佳，小檗堿與蕓薹素內酯、復硝酚鈉復配能促進灰霉菌生長。電鏡觀察發現，經小檗堿和山豆根、爐甘石復配處理的灰霉病菌菌絲扭曲、干癟。田間防效試驗結果表明，10%小檗堿可濕性粉劑1 000倍稀釋液對灰霉病菌的防效為71.7%，小檗堿與山豆根、爐甘石、復硝酚鈉、蕓薹素內酯合用均能增加小檗堿對番茄灰霉病的防效。由此可知，小檗堿可與山豆根、爐甘石、蕓薹素內酯、復硝酚鈉復配用于番茄灰霉病防治。

關鍵詞：小檗堿;復配劑;灰霉病;抑菌活性

中圖分類號：S436.412? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）01-0056-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.01.013? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Inhibition of Berberine with other Components on Botrytis cinerea

LI Peng-yu1，LI Ying1，YANG Tao1，TIAN Ping-fang2，TIAN Guo-ying3，GE Xi-zhen1

（1.College of Biochemical Engineering，Beijing Union University，Beijing 100023，China;

2.College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China;

3.Shijiazhuang Academy of Agriculture and Forestry Science，Shijiazhuang 050000，China）

Abstract： The antibacterial activity of berberine with radix Sophorae tonkinensis，calamine，brassinolide and compound sodium nitrophenolate on Botrytis cinerea was studied by the method of mycelial growth rate and co-toxicity factor. The results showed that both of complex of berberine（0.280 mg/mL） and radix Sophorae tonkinensis （2.257 mg/mL） or berberine（0.155 5 mg/mL） and calamina（0.062 5 mg/mL） had strong inhibition against B. cinerea. However， the mixtures of berberine and brassinolide or compound sodium nitrophenolate could promote the growth of B. cinerea. Scanning electron microscope analysis revealed that the mycelia of B. cinerea manifested abnormity including distortion and collapse. The results of field control experiments showed that the control effect of 10% berberine was 71.7%. Furthermore， berberine combined with radix Sophorae tonkinensis， calamina， brassinolide and compound sodium nitrophenolate could increase the control effect of berberine against Botrytis cinereal. So it could be hypothesized that complex drugs could inhibited the gray mold cell membrane and played an antibacterial effect.

Key words： berberine; mixtures; Botrytis cinerea; antibacterial activity

灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染所致的真菌性植物病害，引起番茄、黃瓜、葡萄等果蔬葉子和果實的腐爛，繼而造成果蔬的腐爛枯死，嚴重影響這些經濟作物的產量[1，2]。目前防治灰霉病以三唑類、吡咯類、嘧啶胺類、甲基硫菌靈、異菌脲等化學藥劑為主[3]。化學藥物不僅作用靶點單一，且藥物殘留對環境和人體都有巨大的危害[4，5]。近年來，尋找合適的生物源殺菌劑和生防菌、減少環境污染、確保食品安全是農藥研究的重點[6，7]。小檗堿作為傳統治療腸胃炎的中藥成分，廣泛存在于黃連、黃柏等植物中，來源豐富，價格低廉[8]。山豆根是越南槐（Radix Sophorae tonkinensis）的干燥根莖，主要成分為生物堿、黃酮、皂苷類物質，常用于治療咽喉腫痛、火毒蘊結[9];爐甘石是一種主要成分為碳酸鋅的復雜礦物集合體，具有解毒明目退翳，收濕止癢斂瘡等功效[10];蕓薹素內酯是一種廣譜植物生長調節劑，能提高農作物的抗病性緩解藥害[11];復硝酚鈉是一種集營養、調節、預防為一體的植物生長調節劑，可與其他抑菌成分復配使用從而提高藥效[12]。前期研究發現，小檗堿對桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）和灰霉病菌（即灰葡萄孢菌）防效好[13，14]。然而在實際生產上不可能僅使用一種殺菌劑。本試驗對小檗堿與山豆根、爐甘石、蕓薹素內酯、復硝酚鈉復配的相容性進行了研究，結果發現，山豆根、爐甘石、蕓薹素內酯、復硝酚鈉單獨使用對番茄灰霉病菌有抑制作用，但最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）均較大。通過探究小檗堿分別與山豆根、爐甘石、云薹素內酯、復硝酚鈉復配對番茄灰霉病菌的抑制作用，以期為小檗堿的研究和指導生產提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

番茄灰霉病菌（ATCC 11542）由北京化工大學提供。小檗堿（簡稱BBR，97%）購自陜西慧科生物發展有限公司，山豆根（10%）、爐甘石購自長安中藥材有限公司，0.1%蕓薹素內酯、0.2%復硝酚鈉購自河南神雨生物科技有限公司，10%小檗堿可濕性粉劑（自制）。

PDA培養基：新鮮去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加去離子水定容至1 000 mL，分裝10瓶待用。

1.2? 方法

1.2.1? 小檗堿及其他成分對灰霉病的毒力測定? 采用菌絲生長速率法[15]測定小檗堿及其他成分分別對番茄灰霉病菌的毒力。將小檗堿與其他成分母液稀釋為一系列濃度，按照表1比例分別加入經115 ℃滅菌25 min后冷卻至55 ℃左右的PDA培養基中，制成系列濃度含成分PDA平板，以加無菌水為空白對照。用直徑為8 mm的打孔器取在28 ℃恒溫培養箱避光培養3 d的灰霉病菌菌餅，接種于含不同成分不同濃度梯度的PDA平板上。將各平板倒置于28 ℃恒溫培養箱內，避光培養，24 h后，每隔12 h用十字交叉法測量并記錄菌落直徑。根據番茄灰霉病菌在不同藥物梯度平板上的生長速率，計算出小檗堿及其他成分對番茄灰霉病的半最大效應濃度（EC50）、不同濃度成分對灰霉病的生長抑制率。其中，菌落直徑=測量菌落直徑平均值-8;抑制率=（空白組菌落直徑-加藥處理組菌落直徑）/空白組菌落直徑×100%。

1.2.2? 小檗堿與其他成分最小抑菌濃度和最小殺菌濃度? 設置分別含小檗堿（0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mg/mL）、10%山豆根（25、50、75、100、125、150 mg/mL）、爐甘石（1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25 mg/mL）、蕓薹素內酯（25、50、75、100、125、150 mg/mL）、復硝酚鈉（25、50、75、100、125、150 mg/mL）的培養基抑制番茄灰霉病菌，將菌餅接種至培養基28 ℃培養，12 h后觀察培養基上番茄灰霉病菌菌絲生長情況，無菌絲生長，則該濃度即為MIC值，72 h后未見菌絲生長的濃度即為MBC值。

1.2.3? 小檗堿與其他成分復配? 根據等效線法[16]，以小檗堿和山豆根為例，按照各自EC50的濃度配制母液，復配比例按照表2分別制備含小檗堿和山豆根的PDA培養基，將8 mm的番茄灰霉病菌菌餅接種到培養基表面中央，28 ℃培養，24 h后采用十字交叉法測量菌落直徑。采用共毒系數法計算共毒因子，若共毒因子大于20，則表示兩藥之間有協同作用;若共毒因子小于-20，則表示兩藥之間有拮抗作用;若共毒因子為-20～20，則表示兩藥之間作用相加。其中，混劑理論抑制率=小檗堿理論抑制率+其他成分理論抑制率;共毒因子=[（混劑實際抑制率-混劑理論抑制率）/混劑理論抑制率]×100%。

1.2.4? 不同成分處理灰霉病菌電鏡觀察? 采用“1.2.2”的方法，設置小檗堿和山豆根、爐甘石復配空白對照和EC50對照組，用玻片覆蓋法采集菌絲，將均勻長著灰霉病菌絲的蓋玻片，用1%戊二醛溶液固定12 h，然后用0.15%戊二醛沖洗;用10%、30%、50%、70%、90%乙醇溶液梯度洗脫5 min，100%乙醇溶液洗脫10 min，充分脫水;真空冷凍干燥;將樣品固定到樣品臺，噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.5? 小檗堿與不同成分復配對灰霉病的田間防效試驗? 田間試驗設在北京市密云番茄種植基地日光室，品種為原味。試驗時間為2016年3月10日至5月12日。田間防治用清水處理作為對照;每個濃度4次重復，共20個小區，隨機排列，每小區500株。施藥時間為3月18日、3月29日、4月10日、4月25日，共計施藥4次。最后一次施藥10 d后調查灰霉病病果率，計算防效。番茄灰霉病的分級標準及藥效計算方法按照《農藥田間藥效試驗準則》進行[17]，記錄病果個數。病果分級采用如下標準：0級，無病斑;2級，殘留花瓣發病或柱頭發病;3級，萼片腐爛或柱頭發病蔓延到果臍部;5級，果臍部有浸潤斑但無霉層;7級，果臍部有霉層但未擴展到其他部位。

藥效計算方法：病果率=（病果數/調查果數）×100%，防治效果=[（對照病情指數-處理區病情指數）/對照區病情指數]×100%）。

1.2.6? 數據處理? 各試驗操作重復3次。用SPSS進行數據處理，所給出的數據均是平均值±標準差;OriginPro9.1 繪圖。

2? 結果與分析

2.1? 小檗堿與其他成分對灰霉病的EC50、MIC及MBC

由表3可知，小檗堿抑制番茄灰霉病菌的EC50為0.311 mg/mL，MIC為3.25 mg/mL，MBC為6.50 mg/mL;10%山豆根對番茄灰霉病菌的EC50為22.570 mg/mL，MIC為150.00 mg/mL，MBC為275.00 mg/mL;爐甘石對番茄灰霉病菌的EC50為0.908 mg/mL，MIC為9.25 mg/mL，MBC為18.75 mg/mL;蕓薹素內酯對番茄灰霉病菌的EC50為6.292 mg/mL，MIC為50.00 mg/mL，MBC為125.00 mg/mL;復硝酚鈉對番茄灰霉病菌的EC50為2.113 mg/mL，MIC為25.00 mg/mL，MBC為100.00 mg/mL。除小檗堿外，其他成分的MIC值與MBC值均偏大，故考慮與其他成分復配使用。

2.2? 小檗堿與其他成分復配對番茄灰霉病的抑制效果

由圖1、圖2可知，小檗堿與爐甘石復配對番茄灰霉病菌有很強的抑制作用，通過空白組（對照）與試驗組對比發現，0.155 5 mg/mL小檗堿+0.062 5 mg/mL爐甘石在菌落生長的各個階段抑菌效果最好，抑菌率超過50%，但試驗中發現，爐甘石的溶解性差，其溶解于培養基的具體濃度并未檢測出。與對照相比，小檗堿與10%山豆根復配對番茄灰霉病菌生長有一定抑制作用;小檗堿與蕓薹素內酯復配對番茄灰霉病菌生長有促進作用;小檗堿與復硝酚鈉復配也有促進番茄灰霉病菌生長的現象。

2.3? 小檗堿與山豆根復配對灰霉病的藥效評價

根據“2.2”試驗結果，選擇了復配成分對灰霉病菌抑制效果較好的小檗堿和山豆根，并對其藥效進行了評價。從表4可以看出，小檗堿與10%山豆根按9a/10+b/10復配時，共毒因子大于20，表明在該復配比下有協同增效作用;按8a/10+2b/10、2a/10+8b/10和a/10+9b/10復配時，共毒因子為20～-20，說明在該復配比下小檗堿和10%山豆根之間有相加作用;其他配比情況下，共毒因子小于-20，表示復配的小檗堿和10%山豆根之間有拮抗作用。因此，小檗堿與10%山豆根的最佳復配為9a/10+b/10，即0.280 mg/mL小檗堿+2.257 mg/mL 10%山豆根。

2.4? 小檗堿與其他成分復配對灰霉病菌菌絲形態的影響

由圖3可知，與處理組相比，正常生長的菌絲平滑、豐滿、粗細均勻。小檗堿與山豆根、爐甘石處理后，菌絲多出現纏繞扭曲，菌絲表面出現斷裂、干癟、褶皺、塌陷等粗細不均的形態，菌絲萎縮脫水嚴重，部分菌絲甚至出現溶解斷裂。基于這些成分處理后菌絲呈現異常的形態變化，表明小蘗堿與山豆根、爐甘石復配對番茄灰霉病有強烈的抑制作用。

2.5? 小檗堿與不同成分復配對灰霉病的田間防效

由表5可知，對照的病果率為31.6%。10%小檗堿可濕性粉劑1 000倍稀釋液單獨使用防效71.7%，小檗堿與山豆根、爐甘石、復硝酚鈉、蕓薹素內酯合用均能增加小檗堿對番茄灰霉病的防效。在實驗室培養番茄灰霉病的情況下復硝酚鈉、蕓薹素內酯均能不同程度促進病原菌生長。

3? 小結與討論

本試驗研究了山豆根、爐甘石、復硝酚鈉及蕓薹素內酯分別與小檗堿復配對灰霉病菌的抑菌效果。結果表明，小檗堿與山豆根、爐甘石復配無論是菌體還是活體均可起抑制作用;在活體試驗中，小檗堿與復硝酚鈉、蕓薹素內酯復配使用可增加復配成分對番茄灰霉病菌的防效，實驗室平板試驗反而促進番茄灰霉病菌的生長。復硝酚鈉、蕓薹素內酯作為新型綠色環保植物生長調節劑，在活體狀態下[18]可促進蔬菜、瓜類、水果等作物生長，改善品質，提高產量，說明小檗堿可與復硝酚鈉、蕓薹素內酯同時使用，小檗堿與不同成分復配不僅通過抑制菌體生長來起到抑菌效果，有可能通過其他間接作用于活體。

本研究采用共毒因子法發現小檗堿和山豆根復配最優配比為0.279 9 mg/mL小檗堿+2.257 mg/mL 10%山豆根，此時共毒因子為33，具有協同增效的作用。山豆根主要活性成分為生物堿類、黃酮類、三萜皂苷類[19]，蔡錦源等[20]發現其有很好的抗氧化及抑菌活性。通過電鏡觀察，推測小檗堿和山豆根復配使用的抑菌機理可能是損壞了菌體的細胞膜，導致細胞凹陷胞內物質外泄，扭曲折斷無法正常代謝。

0.155 5 mg/mL小檗堿+0.062 5 mg/mL爐甘石復配對灰霉病菌的抑菌效果最好。爐甘石[10，21]主要成分為碳酸鋅、氧化鈣，很多研究發現其有收濕斂瘡等功效，然而爐甘石的水溶性較差影響其功效的發揮。通過電鏡觀察，推測小檗堿和爐甘石復配使用的抑菌機制可能是收斂了真菌細胞的水分，導致細胞缺水無法進行正常的生長代謝，從而干癟、脆弱易斷。

目前，關于植物源農藥抑菌機制的報道還很少。后期會在尋找廣譜抑菌物質的同時探索藥物作用靶點，以期為這些成分單獨使用或復配提供適宜、快速的理論指導。

參考文獻：

[1] AQUEVEQUE P，CéSPEDES C L，BECERRA J，et al. Antifungal activities of secondary metabolites isolated from liquid fermentations of Stereum hirsutum（Sh134-11） against Botrytis cinerea（grey mould agent）[J].Food and Chemical Toxicology，2017， 109（2）：1048-1054..

[2] 紀軍建，張小風，王文橋，等.番茄灰霉病防治研究進展[J].中國農學通報，2012，28（31）：109-113.

[3] 劉長令，翟煜翥，張運曉，等.防治灰霉病用殺菌劑的開發[J].農藥，2000，39（3）：1-6.

[4] VAN ASSELT E D，VAN DER SPIEGEL M， NOORDAM M Y，et al. Risk ranking of chemical hazards in food—A case study on antibiotics in the Netherlands[J].Food Research International，2013，54（2）：1636-1642.

[5] 陳曉明，王程龍，薄? 瑞.中國農藥使用現狀及對策建議[J].農藥科學與管理，2016，37（2）：4-8.

[6] 王文橋，馬? 平，韓秀英，等.生物源殺菌劑與化學藥劑協調防控番茄病害[J].中國生物防治學報，2011，27（1）：104-109，49.

[7] 束長龍，曹蓓蓓，袁善奎，等.微生物農藥管理現狀與展望[J].中國生物防治學報，2017，33（3）：297-303.

[8] 李? 波，朱維良，陳凱先.小檗堿及其衍生物的研究進展[J].藥學學報，2008，43（8）：773-787.

[9] HE C M，CHENG Z H，CHEN D F. Qualitative and quantitative analysis of flavonoids in Sophora tonkinensis by LC/MS and HPLC[J].Chinese Journal of Natural Medicines，2013，11（6）：690-698.

[10] 楊連菊，張志杰，李嬈嬈，等.中藥爐甘石的成分分析[J].中國中藥雜志，2012，37（3）：331-334.

[11] 蔣衛杰.有機生態型無土栽培番茄營養生理與優化施肥研究[D].北京：中國農業科學院，2007.

[12] 孫惠敏，李保同，郭明程，等.幾種殺菌劑對柑桔潰瘍病的生物活性[J].江西農業大學學報，2011，33（1）：38-42.

[13] HOU D Y，YAN C Q，LIU H X，et al. Berberine as a natural compound inhibits the development of brown rot fungus Monilinia fructicola[J].Crop Protection，2010，29（9）：979-984.

[14] 裴慶慧，王? 玥，劉宇瑩，等.五種中藥材乙醇提取物對植物病原真菌的抑制作用研究[J].食品工業科技，2016，37（15）：90-95.

[15] 紀明山，祁之秋，王英姿，等.番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性[J].植物保護學報，2003，30（4）：396-400.

[16] 陳? 立，徐漢虹，李云宇，等.農藥復配最佳增效配方篩選方法的探討[J].植物保護學報，2000，27（4）：349-354.

[17] 張秀珍.農業部發布新的農藥田間藥效試驗準則[J].農化新世紀，2008（2）：13.

[18] 汪曉紅，寧偉文，趙? 偉，等.4種藥劑對大豆健康和產量影響的比較研究[J].農藥科學與管理，2017，38（8）：48-53.

[19] TANG L，DONG L N，PENG X J，et al. Pharmacokinetic characterization of oxymatrine and matrine in rats after oral administration of radix Sophorae tonkinensis extract and oxymatrine by sensitive and robust UPLC-MS/MS method[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2013，83：179-185.

[20] 蔡錦源，韋坤華，熊建文，等.山豆根黃酮的提取及抗氧化抑菌活性[J].精細化工，2017，34（3）：285-293.

[21] 裴國獻，顧立強，于立新，等.異體手移植二例報告[J].中華醫學雜志，2000，80（6）：16-20.