愛德華菌免疫刺激下牙鲆相關基因的表達分析

摘要：通過腹腔注射愛德華菌人工感染牙鲆，觀察不同時間段內MyD88基因、IL-1基因及TNF基因表達的情況，并利用實時熒光定量PCR對這些基因進行定量和定性分析。結果表明三基因均參與了牙鲆人工感染愛德華菌后的免疫反應。

關鍵詞：牙鲆;愛德華菌;MyD-88基因;IL-1基因;TNF基因;實時熒光定量PCR

1緒論

目前，對于牙鲆患細菌性疾病——愛德華菌病的控制傳統方法是采用抗生素類藥物。但此方法雖可部分治療愛德華菌病并限制其蔓延，但易造成抗生素類等藥物的積累，使生態環境遭到破壞，打破平衡。因此尋找并開發合適的魚類疾病免疫技術日漸重要。目前，研究魚類免疫系統可為研究育苗、育種，提高魚類的免疫力、促進漁業快速發展提供重要依據。[1]

2方法

2.1愛德華菌培養

將愛德華菌接種到配制的營養培養基上面進行37℃恒溫震蕩培養15小時。

2.2腹腔注射活菌的免疫反應

將培養所得的菌懸液注射到牙鲆魚的腹腔進行免疫。然后將人工感染的牙鲆魚單獨放在循環水族箱中培養，并在之后的0d-7d的每天同一時間取魚的頭腎組織器官進行后續實驗。

2.3RNA抽提

采用QIAGE公司試劑盒進行總RNA的提取。得到樣品后，采用紫外分光光度計進行RNA純度的鑒定。純度鑒定主要是根據在兩個不同波長下的光吸收值的比值大小來決定，即OD260OD280的比值。[2]

2.4cDNA第一鏈的合成

根據QIAGE試劑盒說明書進行相關操作。

2.5實時熒光定量PCR檢測

3結果

3.1總RNA檢測

根據結果計算，RNA的OD260OD280在1.80-2.05之間，說明本次試驗提取的RNA的質量很高。

3.2MyD-88、IL-1和TNF三基因相對表達量計算

時間0d1d2d3d4d5d6d

MyD-8810.410.540.730.141.890.69

IL-110.460.750.330.170.341.72

TNF1290.02503.2546.8531.78582.05119.02

按照生物統計學標準誤差原理計算（P<0.05，n=3），并觀察得到如下結果：

①MyD-88基因的表達量在0d至1d慢慢下降，1d至3d緩慢上升，3d至4d急速下降，4d時達最低值，4d至5d急速上升，5d時達到最大值，5d至7d緩慢下降。

②TNF基因的表達產物在0d至1d時緩慢下降，1d至2d緩慢上升，2d至4d急速下降，4d時達最低值，4d至6d急速上升，6d時達到最大值，6d至7d緩慢下降。

③IL-1基因的表達產物在0d至3d緩慢上升，3d至4d則急速下降，至最低值，4d至5d則急速上升，在5d時達到最大值，后5d至6d緩慢上升，同樣在最后一天再次慢慢回降。

3.3實時熒光定量PCR

根據實時熒光定量PCR的方法檢測結果可知，RT-PCR產物的Tm值（基因表達水平）在79至86范圍內，且82至84之間居多，故產物不是引物二聚體。

4結論

通過本實驗結果，溶解曲線及CT值的分析，可見MyD-88、TNF、IL-1三基因均參與了免疫反應。牙鲆在感染愛德華菌后隨著時間的推移，基因表達的產物量也隨之有所變化，具體表現為在不同的時間內變化的大小不同。該結論為尋找和開發療牙鲆疾病免疫新技術提供一定的可行性。

5討論

硬骨魚類雖然屬于最原始的一種脊椎動物，但他們的免疫系統卻和哺乳動物相似，同樣具有天然性免疫和適應性免疫。[3]當機體外層防御因感染而被破壞時，將會出現天然免疫，此過程伴隨著一系列受細胞因子影響的細胞和介質的參與變化。然而Toll受體又是天然免疫系統中一個重要的通路，故研究Toll受體信號通路及免疫過程中相關細胞因子的變化，進而可加深對天然免疫過程的了解。

牙鲆是我國近岸海水養殖的重要經濟魚類之一，但由于高密度集約化養殖，魚類疾病對此影響日趨嚴重。愛德華菌病是影響魚類健康的致病菌之一，我們通過了解魚類免疫系統及相關過程中細胞因子的變化，可更早的找到適合的方法改善這一問題。也可進一步保護我們的生態環境，為開發魚類免疫藥物提供理論依據。

參考文獻：

[1]唐玫，馬廣智，徐軍.2002魚類免疫學研究進展[J].免疫學雜志，2002，18（3）：113-116.

[2]吳戀，孫金生，耿緒云，潘寶平，魏俊利，王雪慧，高虹.牙鲆Toll樣受體1基因全長cDNA的克隆及特征分析[J].安徽農業科學，2012.40（26）：12754-12755.

[3]邱麗華，張漢華，吳進鋒.魚類腫瘤因子基因和手提的研究進展[J].中國水產科學，2004，9，11（5）：482-287.

作者簡介：孫亞婷（1990-），女，漢族，天津武清人，研究方向：免疫。