大慶油污土壤中石油降解菌的篩選和鑒定研究

程進(jìn)

摘要：從大慶油井旁含油土壤中篩選出兩株石油降解菌，經(jīng)過形態(tài)觀察和生理生化鑒定，最后16SrDNA鑒定。結(jié)果表明：C3J1-2為微小桿菌屬（Exiguobacterium）、A3J1-1為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）。

關(guān)鍵詞：石油降解菌;篩選;鑒定

石油在開采和運(yùn)輸過程中會(huì)發(fā)生儲(chǔ)油罐泄漏、井噴、輸油管道破裂等事故，或是含油廢水排放、有害廢泥漿排放等不良行為，導(dǎo)致大量石油及其產(chǎn)品污染土壤、破壞植被，嚴(yán)重威脅著生態(tài)系統(tǒng)的平衡和安全。[1]探索高效、經(jīng)濟(jì)的處理方法修復(fù)石油污染土壤，對(duì)于生態(tài)環(huán)境具重要意義。[2]生物修復(fù)技術(shù)具有環(huán)境友好、成本低廉、操作簡(jiǎn)便、對(duì)操作人員危害小、作用徹底等特點(diǎn)，越來越引起人們的重視，被廣泛應(yīng)用到環(huán)境污染治理領(lǐng)域。[3]本人從油井附近油污土壤中篩選出三株石油降解菌，經(jīng)過鑒定其中C3J1-2為微小桿菌屬（Exiguobacterium）、E1J4-1和A3J1-1為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）。前人關(guān)于微小桿菌屬（Exiguobacterium）降解石油烴的論文較少。

1實(shí)驗(yàn)方法

1.1篩選

參照董丁[4]論文配置培養(yǎng)基《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[5]配置所需培養(yǎng)基，取2g從大慶油井附近采集的油污土，使用前一直置于-80℃環(huán)境。將土壤置于含油10%的100ml無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，并加入幾顆玻璃珠，在160rpm、30℃條件下?lián)u床震蕩培養(yǎng)5d后，取10ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到新的含油無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，160rpm、37℃條件繼續(xù)搖床震蕩培養(yǎng)5d，連續(xù)馴化傳代5次。

取100μL培養(yǎng)液涂布于油平板上，置于37℃培養(yǎng)16h，挑取不同形態(tài)和顏色的單菌接種于含油培養(yǎng)基中，連續(xù)劃線培養(yǎng)3次，直至鏡檢無雜菌，得到純化菌株。分離出的菌株轉(zhuǎn)接到石油固體培養(yǎng)基并生長(zhǎng)良好，則認(rèn)為該菌具有潛在的降解石油烴特性，即為待篩菌株。

1.2鑒定

觀察三株細(xì)菌的菌落形態(tài)邊緣、顏色和透明度等并做好記錄，其次參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[6-7]進(jìn)行細(xì)菌生理生化試驗(yàn)，最后依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

1.316SrDNA鑒定

參照王立秀[10]研究，利用提取的細(xì)菌基因組DNA模板，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)篩選出的石油降解菌的16SrDNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。

2分析

2.1石油降解菌特征

通過觀察得出：菌株C3J1-2菌落呈圓形、淺黃色、菌落正反面顏色差別不大、有異味、菌落中部凸起、表明光滑、濕潤(rùn)、有光澤、菌落不透明、邊緣不整齊;菌株A3J1-1菌落呈圓形、乳白色、菌落正反面顏色差別不大、無異味、菌落中部凸起、表明光滑、濕潤(rùn)、有光澤、菌落不透明、邊緣整齊。

2.2生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

菌株C3J1-2的革蘭氏染色為陽性，接觸酶試驗(yàn)陽性，氧化酶陰性，V-P實(shí)驗(yàn)陰性，好氧性為陽，硝酸鹽為陽，甲基紅試驗(yàn)為陰，明膠水解為陽，淀粉水解為陽，油脂水解為陰，石蕊牛奶試驗(yàn)為陰，吲哚試驗(yàn)為陽，葡萄糖發(fā)酵不產(chǎn)氣;菌株A3J1-1革蘭氏染色為陰性，接觸酶試驗(yàn)陽性，氧化酶陰性，V-P實(shí)驗(yàn)陰性，好氧性為陽，硝酸鹽為陰，甲基紅試驗(yàn)為陰，明膠水解為陰，淀粉水解為陽，油脂水解陽，石蕊牛奶試驗(yàn)為陽，吲哚試驗(yàn)為陽，葡萄糖發(fā)酵不產(chǎn)氣。

2.316SrDNA鑒定

將測(cè)得的16SrDNA序列提交至GenBank，下載同源性達(dá)97%以上的序列，用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。最終得出，鑒定C3J1-2為微小桿菌屬（Exiguobacterium）、E1J4-1和A3J1-1均為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）。

3結(jié)論展望

最終得出，鑒定C3J1-2為微小桿菌屬（Exiguobacterium）、E1J4-1和A3J1-1均為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）。本研究豐富了石油烴降解菌的研究，為石油污染的微生物修復(fù)提供了菌種資源和相關(guān)信息。可以深入進(jìn)一步研究細(xì)菌的具體降解效果，未更好發(fā)揮細(xì)菌作用提供參考。

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