枯草芽孢桿菌發酵培養基及發酵條件優化

焉兆萍 宋士良 陸克文

摘? 要：本文對枯草芽孢桿菌的發酵培養基和發酵條件進行了篩選優化。采用單因素試驗和正交試驗方法，確定該枯草芽孢桿菌的優化培養基為：豆粕40 g/L、玉米粉20 g/L、葡萄糖15 g/L、磷酸氫二鉀3 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸銨0.35 g/L、酵母浸粉0.2 g/L、硫酸錳0.2 g/L、硫酸亞? ?鐵0.1 g/L、碳酸鈣0.1 g/L。最適發酵條件為：初始pH 7.2，接種量5%，發酵溫度35 ℃，搖床轉速250 r/min。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌;發酵培養基;發酵條件

中圖分類號：TQ920.6 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2019）01-0051-05

枯草芽孢桿菌是嗜溫、好氧、產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，在自然界中廣泛存在，對人畜無毒無害，且不污染環境;能產生多種抗菌物質和酶，具有廣譜抗菌活性。該菌已被我國農業農村部列入飼料添加劑目錄名單，越來越多地被研制成微生物制劑，其制劑作為“綠色”飼料添加劑，在畜牧養殖業、飼料加工業中得到廣泛應用，成為現代養殖業的一種常規添加劑，具有廣闊的發展前景[1]。枯草芽? 孢桿菌在動物腸道內具有較強的生物奪氧能力，這對動物的營養物質利用、生長、防病起到重要作用[2];其還可以通過產生抗體和提高嗜菌作用等，刺激免疫，激發體液免疫與細胞免疫，從而提高動物的生產性能和飼料利用率[3]。由于枯草芽孢桿菌生長速度快、營養需求簡單、易于存活、無致病性，具有良好的發酵基礎，國內外已有眾多學者對此菌進行了大量研究[4]。

本文通過單因素試驗與正交試驗，對枯草芽孢桿菌的發酵培養基和發酵條件進行了研究，確定其最佳發酵培養基和最適發酵條件，以最大限度地提高枯草芽孢桿菌的發酵菌數，降低生產成本，滿足工業化發酵生產的要求。

1? 材料與方法

1.1 供試菌種

枯草芽孢桿菌，由上海邦成生物工程有限公司菌種保藏室提供。

1.2 培養基

LB固體培養基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化鈉10 g、瓊脂粉20 g、水1 000 mL，pH 7.2。

LB液體種子培養基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化鈉10 g、水? 1 000 mL，pH 7.2。

1.3 種子液的制備

將菌種接種于LB固體培養基中，37 ℃恒溫培養箱活化18 h后，挑取單菌落接入裝有100 mL LB液體種子培養基的250 mL三角瓶中，37 ℃條件下180 r/min振蕩培養24 h。

1.4 液體種子生長曲線的測定

將液體種子以1%接種量分別接入盛有100 mL種子液體培養基的250 mL三角瓶中，37 ℃條件下180 r/min搖床培養16 h、17 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h、25 h、26 h和27 h，分別取樣測其吸光度（OD600）。

1.5 發酵培養基的篩選及優化

選擇12種不同發酵培養基進行篩選，種子液以2%接種量接入盛有100 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，37 ℃條件下180 r/min搖床培養72 h，采用平板菌落計數法檢測細菌總數，確定最佳發酵培養基[5-17]。

不同發酵培養基配方組成如下：

（1） 麥芽浸粉1 g/L、黃豆粉（過80目篩） 15 g/L、碳酸鈣6.68 g/L、硫酸錳0.4 g/L、氯化鎂2 g/L，pH 7.2。

（2） 可溶性淀粉10 g/L、酵母膏10 g/L、磷酸氫二鉀1.5 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、氯化鈣0.1 g/L，pH 7.2。

（3） 玉米淀粉15.86 g/L、玉米漿干粉12.68 g/L、氯化銨19.98 g/L，pH 7.2。

（4） 蛋白胨30 g/L、甘油10 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、硫酸鎂1.5 g/L，pH 7.2。

（5） 玉米淀粉25.3 g/L、黃豆粉（過80目篩）49.5 g/L、酵母膏13 g/L、磷酸氫二鉀1.1 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、氯化鈣0.1 g/L、硫酸錳0.1 g/L，pH 7.2。

（6） 葡萄糖15 g/L、酵母浸粉5 g/L、硫酸鎂5 g/L，pH 7.2。

（7） 酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、蔗糖12 g/L、氯化鈉5 g/L，pH 7.2。

（8） 玉米淀粉15 g/L、玉米漿干粉12 g/L、酵母膏1.5 g/L、氯化銨3 g/L、硫酸鎂0.3 g/L、硫酸錳0.15 g/L、氯化鈣0.1 g/L，pH 7.2。

（9） 蛋白胨5 g/L、酵母浸粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、牛肉膏粉5 g/L、磷酸氫二鉀? 2 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L，pH 7.2。

（10） 豆粕20 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉10 g/L，pH 7.0。

（11） 豆粕20 g/L、葡萄糖5 g/L、玉米淀粉5 g/L、氯化鈉5 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、磷酸氫二鉀3 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、酵母浸粉0.2 g/L、硫酸亞鐵0.1 g/L、碳酸鈣0.1 g/L、硫酸錳0.2 g/L，pH 7.0。

（12） 玉米淀粉20 g/L、蛋白胨5 g/L、豆粕10 g/L、硫酸銨0.5 g/L、碳酸鈣1 g/L，pH 7.0。

1.6 發酵條件的優化

1.6.1 最佳培養溫度的測定

采用篩選出的10號培養基，液體種子以2%接種量接入盛有100 mL發酵培養基的 500 mL三角瓶中，分別在30 ℃、35 ℃、 37 ℃和40 ℃條件下，180 r/min搖床培養? 72 h，采用平板菌落計數法檢測細菌總數，確定最佳發酵溫度。

1.6.2 最佳生長pH的測定

采用篩選出的10號培養基，發酵培養基初始pH分別調至6.0、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、8.0，種子液以2%接種量接入盛有100 mL發 酵培養基的500 mL三角瓶中，37 ℃條件下180 r/min搖床培養72 h，采用平板菌落計數法檢測細菌總數，確定最佳初始pH。

1.6.3 接種量的影響

采用篩選出的10號培養基，將種子液接種量分別調節為搖瓶裝液體積的1%、2%、5%、7%和10%，37 ℃條件下180 r/min搖床培養72 h，采用平板菌落計數法檢測細菌總數，確定最適接種量。

1.6.4 裝液量對細菌生長的影響

采用篩選出的10號培養基，種子液以2%接種量分別接入裝有50 mL、75 mL、? ? ?100 mL、125 mL、150 mL液體發酵培養基的500 mL三角瓶中，37 ℃條件下180 r/min搖床培養72 h，采用平板菌落計數法檢測細菌總數，確定最適裝液量。

1.6.5 搖床轉速對細菌生長的影響

采用篩選出的10號培養基，液體種子以2%接種量接入盛有100 mL發酵培養基的? ? ? 500 mL三角瓶中，37 ℃條件下搖床培養72 h，搖床轉速分別設定為150 r/min、180 r/min、200 r/min和250 r/min，采用平板菌落計數法檢測細菌總數，確定最適轉速。

1.7 發酵培養基的優化

在確定好發酵培養基碳源與氮源的基礎上，采用三因素三水平的正交試驗表[L9（33）]進行試驗。種子液以5%接種量接入裝有? ?50 mL初始pH 7.2液體發酵培養基的500 mL三角瓶中，35 ℃條件下250 r/min搖床培養? 72 h，采用平板菌落計數法檢測細菌總數。

2? 結果與分析

2.1 菌株生長曲線的測定

菌株在LB液體種子培養基中，37 ℃培養時間為23 h時的OD600為最大值，因此選擇培養23 h為液體種子生長時間。

2.2 發酵培養基的篩選

培養基的篩選結果見表1。從試驗結果可以看出，10號培養基搖瓶培養，細菌總數最高值為40.5億CFU/mL。因此可選用10號培養基作為發酵培養基。

2.3 發酵條件的優化

2.3.1 培養溫度對發酵菌數的影響

35 ℃培養發酵菌數最高，37 ℃次之，30 ℃和40 ℃條件下發酵細菌總數明顯較低。因此，選擇35 ℃為最佳發酵溫度。

2.3.2 初始pH對發酵菌數的影響

搖瓶發酵中pH難以控制，一般控制其初始pH。初始pH 7.0時發酵菌數為35億CFU/mL，初始pH 7.2時發酵菌數可達到39億CFU/mL，明顯高于其他初始pH的發酵菌數，因此選擇適宜初始pH為7.2。

2.3.3 接種量對發酵菌數的影響

分別采用1%、2%、5%、7%和10%五個接種量梯度進行搖瓶培養。一定范圍內，發酵菌數隨接種量的增加而增加，5%接種量以上發酵菌數不再增加，因此5%接種量為最適接種量。

2.3.4 裝液量對發酵菌數的影響

裝液量越多發酵菌數越低。枯草芽孢桿菌為需氧菌，在一定培養條件下，裝液量越少發酵菌數越高。因此選擇最適搖瓶裝液量為50 mL。

2.3.5 搖床轉速對發酵菌數的影響

搖床轉速越高發酵菌數越大。轉速小，通氣量小，不利于枯草芽孢桿菌的生長。因此該菌的適宜搖床培養轉速為250 r/min。

2.4 發酵培養基的優化

碳源與氮源優化的正交試驗因素水平? 見表2，優化結果見表3。從表中可以看出，發酵培養基中豆粕、葡萄糖和玉米粉的用量對枯草芽孢桿菌的生長均產生一定影響，從極差R的大小來看，各因子作用的主次順序為A>C>B，即豆粕的用量對菌體增殖的影響最為顯著，玉米粉次之，葡萄糖影響最小。以發酵菌數作為評價指標，最佳表現組合為A2B1C2，即豆粕40 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉20 g/L為碳源、氮源用量的最佳組合。

3? 結論

由試驗結果可知，培養溫度、培養基初始pH、接種量、搖床轉速等培養條件和發酵培養基的組成對菌株的生長有很大影響。本文采用單因素試驗和正交試驗方法，確定該枯草芽孢桿菌的優化發酵培養基組成為：豆粕40 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉20 g/L。最適發酵條件為：發酵溫度35 ℃，初始pH 7.2，接種量5%，搖床轉速250 r/min。采用此種配比發酵培養72 h后細菌總數可達162億CFU/mL，本試驗結果為大規模工業化發酵生產提供了有益借鑒。

參考文獻：（17篇，略）