C反應蛋白對巨噬細胞分泌趨化因子CXCL16影響的研究

陳靜文 王審 林冬銘 黃抒偉

冠心病的發病機制一直是研究熱點。近年新發現的CXC趨化因子配體16（CXCL16）既具有趨化因子的功能，同時還可作為清道夫受體吞噬氧化的低密度脂蛋白，促進泡沫細胞形成[1］，此外CXCL16還有促進平滑肌細胞、內皮細胞增殖，增加細胞與細胞間黏附，刺激血管生成的作用[2］。C反應蛋白（CRP）是一個最強的獨立于血脂預測作用的心血管疾病預測因子。CRP參與急性冠脈綜合征形成和進展的各個階段，包括內皮功能異常、內皮活化、斑塊形成及斑塊破裂等[3］。Han等[4］體外實驗研究發現，重組人CRP可上調單核細胞中CC趨化因子受體2的表達，促進由單核細胞趨化因子-1介導的對單核細胞的趨化作用。而同為趨化因子家族成員的CXCL16，是否與CRP存在某些聯系？目前國內外較少這方面的研究，本文通過體外培養THP-1細胞，在藥物誘導下轉化為巨噬細胞，檢測在CRP干預下巨噬細胞分泌CXCL16水平的變化情況，探討這兩種炎性標志物之間的關系，現將研究結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 人單核細胞白血病細胞系THP-1細胞由中科院上海細胞所提供；主要試劑:重組人CRP（德國Merck公司）；CXCL16ELISA試劑盒（美國R＆D公司）；FBS（杭州四季青公司）；佛波醇（美國sigma公司）；改良型RPMI1640培養基（美國GIBCO公司）；總RNA提取劑TRIZOL Reagent（美國invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒（加拿大Fermentas公司）；CXCL16引物及內參（由上海生工公司設計）。CXCL16引物:上游引物5’-ACTCAGCCA GGCAATGGCAAC-3’；下游引物 5’-GGTATTAGAG TCAGGTGCCAC-3’；擴增片段長度為693bp。擴增內參照磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因:上游引物 :5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’； 下 游 引物:5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’；擴增片段長度:350bp。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及誘導 將THP-1細胞與10ml含有10%FBS的RPMI1640培養液加至培養瓶中，置于5%CO2、37℃溫箱中，飽和濕度下常規培養，待培養液發黃后1～2d傳代，當培養瓶中細胞培養至活細胞數達5×106個/ml時，將細胞接種于6孔培養板中，共接種25個孔，每孔接種3ml細胞液，給予佛波醇（60ng/ml）處理24～48h，在倒置顯微鏡下觀察細胞呈現形狀不規則且貼壁生長，即為誘導成功[5］，開始計時。

1.2.2 ELISA法檢測CXCL16水平 無菌管收集5個時間點（6、12、24、48、72h）巨噬細胞培養液，離心后取上清液置于-80℃冰箱中備用。采用ELISA法檢測5個時間點細胞上清液CXCL16水平。

1.2.3 CRP干預實驗 （1）將誘導成功的巨噬細胞分為 5 組，分別加入 0、5、10、20、50μg/ml CRP 至培養孔共同孵育。至巨噬細胞分泌CXCL16水平最高的時間點時收集上清液，采用ELISA法檢測CXCL16水平。（2）RT-PCR:提取5組巨噬細胞RNA，各管取5μlRNA放入EP管中，70℃水浴箱中孵育10min，進行基因擴增，反應條件為25℃5min、42℃60min、70℃ 5min、99℃ 10min。取逆轉錄產物 2μl置于 EP 管中，順序加入:氯化鎂（1.5μl）、10×反應液（2.5μl）、無核酸酶水（16.75μl）、三磷酸脫氧核苷酸混合溶液（0.5μl）、上游引物（0.75μl）、下游引物（0.75μl）、DNA 聚合酶（0.25μl）。設置 PCR 反應條件為:94℃3min預變性，94℃30s變性，58℃30s退火，72℃45s延伸，34個循環，72℃繼續延伸10min。PCR反應結束后，取5μl擴增產物與1μl 6×反應液混合后用10g/L的瓊脂糖凝膠恒壓100V電泳30min，利用紫外分析儀對電泳結果進行觀察并拍照。對PCR電泳結果進行灰度值掃描并半定量分析。計算5組CXCL16與相應的內參GAPDH基因PCR產物的灰度值之比，比較5組CXCL16基因mRNA的相對表達水平。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 THP-1誘導為巨噬細胞后不同時間點分泌CXCL16水平情況 見圖1。

圖1 THP-1誘導為巨噬細胞后不同時間點分泌CXCL16水平情況

由圖 1 可見，6、12、24、48、72h 分泌 CXCL16 水平分別為:（52.911±6.802）、（168.635±13.051）、（506.597±18.853）、（325.459±13.850）、（166.979±12.358）ng/L。12h與72h比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；其余時間點兩兩比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。5個時間點中，24h為CXCL16分泌水平高峰。

2.2 5組巨噬細胞分泌CXCL16水平比較 見圖2。

由圖2可見，5組巨噬細胞分泌CXCL16水平分別為:（518.363±12.438）、（641.161±13.438）、（825.002±15.186）、（1129.026±16.853）、（1611.443±19.962）ng/ml。組間兩兩比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。

2.3 5組巨噬細胞CXCL16基因RT-PCR電泳結果及mRNA的相對表達水平比較 見圖3。

圖2 5組巨噬細胞分泌CXCL16水平比較

圖3 5組巨噬細胞與不同濃度CRP共同孵育后，CXCL16基因、內參GAPDH基因RT-PCR電泳結果及mRNA的相對表達水平比較（A:CXCL16基因PCR電泳照片；B:內參GAPDH基因PCR電泳照片；C:5組CXCL16與內參GAPDH基因PCR產物灰度值之比）。

由圖 3可見，5組 CXCL16與 GAPDH基因PCR產物灰度值之比分別為:0.120±0.011、0.230±0.015、0.502±0.021、0.808±0.015、1.082±0.008，組間兩兩比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。隨著CRP干預劑量的增加，巨噬細胞分泌CXCL16的水平和CXCL16mRNA的表達呈劑量依賴性增加。

3 討論

動脈粥樣硬化不僅是簡單的脂質堆積，其中涉及到內皮功能、炎癥因子以及多種血液因素之間的相關作用，炎癥反應貫穿于粥樣硬化斑塊的形成、演變以及破裂的整個病理過程[6］。炎癥細胞與血管內環境中的細胞、細胞因子、炎癥介質等的相互作用極其復雜，而趨化因子則是聯系炎癥與動脈粥樣硬化發生的樞紐。CXCL16作為與動脈粥樣硬化相關的重要炎癥因子，目前的臨床研究很多， Ma等[7］對227例急性缺血性卒中患者臨床研究發現，血清CXCL16水平與發生動脈粥樣硬化性腦卒中密切相關。Lehrke等[8］檢測了464例冠心病患者及235例正常人的血清CXCL16水平，結果也顯示冠心病患者CXCL16水平明顯高于正常人，尤其是急性冠脈綜合征患者。目前國內外關于CXCL16與動脈粥樣硬化相關的多種炎癥因子關系的研究甚少，許多作用機制和途徑仍有待進一步研究證實。

本實驗之所以選擇THP-1細胞來進行研究，是由于該種細胞培養技術已成熟，且誘導為巨噬細胞的條件可靠，簡單易行。而選擇了CRP作為干預因素，是因為它是冠心病的發病機制中具有重要地位的一種急性期蛋白。盡管最初認為CRP僅僅作為血管炎癥的一個標志物在動脈粥樣硬化斑塊的形成中發揮作用，但最近的研究已證明:它還可以起到更為主動的作用。它可以直接參與到病變的形成、斑塊的破裂以及血栓的生成中，可以促進單核細胞的聚集、浸潤到血管壁內，并發展為泡沫細胞，在動脈粥樣硬化斑塊部位可以發現有CRP沉積在血管壁上。Minako等[9］研究發現將一定濃度的CRP與人血管內皮細胞孵育后可刺激IL-18的分泌，提示冠心病患者循環血中的CRP可能通過上調IL-18而產生一系列炎癥反應，而目前認為IL-18又可上調CXCL16的分泌，這就將CRP與CXCL16相聯系起來。大規模的人群調查發現穩定性心絞痛患者血清CRP濃度≥5μg/ml，而急性冠脈綜合征患者則≥10μg/ml[10］。因而實驗組選擇了 5、10、20、50μg/ml作為 CRP 的干預劑量。實驗結果經統計學分析后發現隨著加入CRP劑量的增加，巨噬細胞分泌CXCL16的水平及CXCL16mRNA表達也上調。基于體外細胞培養水平，此次研究闡明了CRP與CXCL16之間存在相關性:CRP可作用于巨噬細胞，刺激CXCL16的表達，提示在動脈粥樣硬化發病過程中，這兩種具有代表性的重要炎癥因子之間存在著相互作用。

雖然目前CRP和CXCL16之間具體作用機制尚不清楚，但已經有一些相關的實驗室研究提供了方向和思路。在一項關于心血管疾病與慢性阻塞性肺病相關的炎癥反應發生機制的關系研究中發現，吸煙可通過增強血管內皮細胞Nox5的表達、RhoA/p38 MAPK/NF-κB信號通路激活從而上調CXCL16的表達[11］。在臨床上，我們發現部分動脈粥樣硬化患者盡管接受了嚴格生活方式指導以及最優化的藥物治療，內環境中的炎癥及免疫反應仍然持續存在，導致疾病反復甚至進展[12］。Ridker等[13］報道了CANTOS研究的初步結果，所有入選患者均診斷“急性心肌梗死”并且伴有超敏CRP升高，隨機分為兩組，分別及接受Canakinumab（人白細胞介素-1β的單克隆抗體，目前已被批準應用于臨床風濕疾病的治療）及安慰劑治療3個月。與安慰劑組比較，Canakinumab組超敏CRP明顯降低，且呈劑量依賴性，同時并不降低外周血的LDL-C水平。3個月后Canakinumab組一級終點事件（非致死性心肌梗死、非致死性卒中、心血管死亡）發生率更低。CANTOS研究更進一步證實了冠心病的炎癥假說。在信號通路方面，Wenlin等[14］發現他汀在冠心病患者治療過程中通過抑制IL-1β和NF-κB信號通路來發揮其抗炎作用。在本實驗研究基礎上還可以繼續探討CRP影響CXCL16表達的作用途徑并可實施藥物干預實驗，為動脈粥樣硬化性心血管疾病的治療提供新的思路及靶點。