阿托伐他汀經LOX-p38-MMP-2信號軸逆轉糖尿病心肌病大鼠心肌組織纖維化的研究

王紀人 劉會 楊帆

糖尿病發(fā)生后，高糖毒性及胰島素抵抗等因素可誘導多種細胞因子過度表達，引起成纖維細胞增生和膠原纖維沉積，最終引起心肌細胞肥大及細胞外基質重塑及心功能衰竭，形成糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）。賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）使膠原纖維及彈性纖維穩(wěn)定[1］，LOX 表達過多可導致組織纖維化[2］。既往我們的研究也證實，LOX參與慢性心力衰竭小鼠心肌組織的重塑，阿托伐他汀可逆轉這一現(xiàn)象[3］。目前的研究多涉及LOX參與心臟重塑，但LOX逆轉糖尿病心肌病大鼠心肌組織纖維化與LOX-p38-基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）信號軸的相關性尚未涉及。本實驗擬通過觀察阿托伐他汀逆轉糖尿病心肌病大鼠心肌組織纖維化與LOX-p38-MMP-2信號軸的關系，為臨床應用他汀類藥物抑制心室重塑提供一定的理論基礎，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 試驗動物與分組 選取8周、52～58g、SPF級健康雄性SD大鼠40只 [合格證編號:SCXK-（渝）2012-0005］，應用隨機數(shù)字表法分為3組:DCM組15只；治療組15只；對照組10只。所有動物置于動物房內予顆粒飼料 [許可證號:SCXK-（粵）2008-0002］飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶解于pH 4.5的0.1mmol/L枸櫞酸緩沖溶液中，DCM組及治療組大鼠腹腔注射STZ 65mg/kg[4］，72h后，測定大鼠尾靜脈血糖，≥16.7mmol/L則認為糖尿病動物模型造模成功，期間DCM組及治療組各死亡3只（20%）。注射鏈脲佐菌素72h后，治療組予阿托伐他汀2mg·kg-1·d-1灌胃，DCM組予以等量0.9%氯化鈉注射液灌胃。對照組正常飲食，自由飲水。

1.2.2 超聲心動圖檢測 試驗8周末，腹腔注射7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉所有大鼠，采用VisualSonics Vevo770超聲心動圖儀（探頭17.5MHz）測量各大鼠心臟超聲參數(shù)，包括左心室舒張末期內徑（LVEDd）、左心室收縮末期內徑（LVESd），并計算左心室射血分數(shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS）。

1.2.3 左心室質量指數(shù)（LVMI）測定 試驗8周末，麻醉下開胸取出完整的心臟，除去心外膜，沿著房室隔除去右心室、左心房和右心房，并保留室間隔。冷肝素鹽水用于清潔心腔中的殘余血液。濾紙吸干水份并稱取左心室質量，計算LVMI。LVMI=LVM（mg）/體質量（g）。其后切取部分心肌置于4%多聚甲醛中固定，用于HE及Masson染色；其余心肌凍存于液氮中用于檢測RNA和蛋白質。

1.2.4 心肌纖維化面積測定 采用HE、Masson染色方法，經過多余甲醛固定的心肌組織予脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片、常規(guī)脫蠟至水。HE染色:蘇木素漂染5min，1%鹽酸酒精分化洗滌5s，梯度酒精脫水各10min，伊紅漂染5s，樹膠封片。Masson染色:蘇木素漂染5min，蒸餾水漂洗5min，磷鉬酸分化，苯氨藍漂染2min，二甲苯透明后樹膠封固。組織切片置于Leica光學顯微鏡下進行拍照并分析，參照文獻[5］測定心肌纖維化（myocardial fibrosis，MIFI）面積。

1.2.5 RNA相對表達量測定 采用實時熒光定量PCR法，按照試劑盒說明術提取液氮中凍存的心肌組織總RNA，并計算總RNA純度。采用Icyclery IQ real-time PCR儀按照試劑盒說明書操作測定LOX和MMP-2 mRNA表達水平。所有引物均由大連晨鈺生物有限公司合成，序列由Genebank提供，β肌動蛋白（β-actin）上游引物:5’-TTGTTCCTACTTAT GGAATCCT-3’，下游引物:5’-GTTCGGCATCATGC TGCCTA-3’，擴增片段為 354bp；LOX 上游引物：5’-ACGCTTGTTCGCTCAGTAGAG-3’，下游引物:5’-A GCTCCGTTCTCGCTTCTAGC-3’，擴增片段為148bp；MMP-2 上游引物:5’-ACGCGTGCTTACTGATGAGAG-3’，下游引物:5’-ACTTGCTATCTGGTATGCAGC-3’，擴增片段為246bp。反應條件為:預變性95℃×10min，變性 95℃×10s，退火 /延伸 60℃×45s，循環(huán) 37 次。

1.2.6 蛋白相對表達量測定 采用Western blot法檢，按照試劑盒說明書提取液氮中凍存的心肌組織全蛋白測定蛋白濃度。取50μg全蛋白進行8%SDS-PAGE電泳分離蛋白后并進行轉膜，15%牛奶-PBST溶液室溫下封閉60min，室溫下加入一抗，抗體與膜充分結合后置于4℃冰箱過夜（β-actin:鼠抗單克隆抗體，1∶2 000；p38:鼠抗單克隆抗體，1∶500；磷酸化 p38:鼠抗單克隆抗體，1∶500；MMP-2:鼠抗單克隆抗體，1：500），第2天室溫下PBS洗滌10min×5次，加入HRP標記的二級抗體（β-actin:羊抗小鼠，1∶20 000；p38:兔抗鼠，1∶2 000；磷酸化p38:兔抗鼠，1∶2 000；MMP-2:兔抗鼠，1∶500）結合 60min，PBST漂洗 10min×5次，ECL法發(fā)光顯像，X線壓片曝光并掃描，用Imag系統(tǒng)對條帶進行灰度分析，計算目標蛋白的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠一般情況比較 對照組10只大鼠無一只死亡；DCM組大鼠存活6只（40.0%）；治療組存活8只（53.3%）。DCM組及治療組大鼠精神及活動量均較對照組稍差。

2.2 3組大鼠超聲心動圖指標比較 見表1。

表1 3組大鼠超聲心動圖指標比較

由表1可見，3組大鼠4項超聲心動圖指標比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。DCM組、治療組LVEDd和 LVESd均高于對照組，LVEF及LVFS均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。治療組LVEDd和LVESd低于對照組，LVEF及LVFS高于DCM組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.3 3組大鼠LVMI及MIFI比較 見表2。

由表2可見，DCM組大鼠LVMI、MIFI均高于對照組；治療組大鼠LVMI和MIFI較DCM組低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表2 3組大鼠LVMI及MIFI比較

2.4 3組大鼠心肌組織HE及Maason染色 見圖1-2。

圖1 3組大鼠左心室心肌組織HE染色（A:DCM組；B:治療組；C:對照組；×400）

圖2 3組大鼠左心室心肌組織Masson染色（A:DCM組；B:治療組；C:對照組；×400）

由圖1-2可見，HE染色顯示，對照組大鼠心肌組織排列整齊，未見水腫及核破裂；DCM組大鼠則出現(xiàn)心肌細胞明顯水腫及排列紊亂，可見部分心肌纖維斷裂及核破裂；治療組大鼠心肌損害較DCM組有所減輕。Masson染色顯示，對照組心肌膠原纖維正常，未見纖維化現(xiàn)象；DCM組大鼠心肌組織膠原纖維明顯增多、纖維化明顯，治療組大鼠心肌組織膠原纖維較DCM組明顯減少，纖維化有所減輕。

2.5 3組大鼠左心室心肌組織LOX和MMP-2 mRNA的表達水平比較 見表3。

由表3可見，DCM組大鼠心肌組織LOX和MMP-2 mRNA表達較對照組明顯增加。與DCM組比較，治療組大鼠心肌組織LOX和MMP-2 mRNA表達較低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。

表3 3組大鼠左心室心肌組織LOX和MMP-2 mRNA的表達水平比較

2.6 3組大鼠左心室心肌組織LOX、MMP-2、p38和磷酸化p38蛋白表達水平的比較 見表4，圖3。

表4 3組大鼠左心室心肌組織LOX、MMP-2、p38和磷酸化p38蛋白表達水平的比較

圖3 3組大鼠左心室心肌組織LOX、MMP-2、p38和磷酸化p38蛋白表達（1:對照組；2:DCM組；3:治療組）

由表 4可見，DCM組大鼠心肌組織 LOX、MMP-2和磷酸化p38表達較對照組明顯增加，治療組大鼠心肌組織LOX、MMP-2和磷酸化p38表達較DCM組明顯下調，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。3組大鼠心肌組織p38表達比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.7 大鼠左心室心肌組織LOX、MMP-2和磷酸化p38與心肌重構指標的關系 DCM組大鼠左心室心肌組織MIFI與LOX、MMP-2和磷酸化p38均呈正相關（r=0.74、0.71、0.64，均P＜0.05）。

3 討論

糖尿病現(xiàn)已成為威脅人類健康的隱形殺手，其發(fā)病率居高不下，DCM是糖尿病晚期最常見的并發(fā)癥之一，在糖尿病病程中，高糖毒性損傷心肌細胞及細胞外基質，可引起心肌細胞肥大及細胞外基質增生，引起心功能不全[6］。我們的研究結果表明，糖尿病心肌病大鼠左心室擴大、LVEF及LVFS下降、心肌組織明顯纖維化，而應用阿托伐他汀治療后大鼠心功能有所好轉，心肌組織纖維化明顯有所減輕。

LOX在維持組織性能學穩(wěn)定方面發(fā)揮重要的作用，只有適量的LOX表達才能維持組織的正常功能，LOX表達與組織纖維化程度呈正相關[1，7］。有研究研究表明，對慢性心力衰竭心肌組織進行HE染色及測定心肌組織LOX mRNA及蛋白發(fā)現(xiàn)，LOX過度表達與心肌纖維化呈正相關，抑制LOX表達后，心肌纖維化明顯減輕[8］。在擴張型心肌病患者心肌組織中，LOX及TGF-β表達均明顯升高，且TGF-β通過上調LOX表達，促使Ⅲ型膠原纖維蛋白的合成及激活MMP活性增加，而且LOX表達上調與心肌纖維化相關[9］。Xiao等[10］研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死的獼猴心肌組織中LOX表達明顯升高，且LOX升高與心肌纖維化程度相關。此外還有研究發(fā)現(xiàn)，結扎冠狀動脈前降支的心肌梗死大鼠，檢測心肌組織LOX蛋白發(fā)現(xiàn)，心肌梗死大鼠心肌組織LOX表達明顯升高，并與心肌纖維化程度呈正相關[11］。此外，制作主動脈左心室瘺引起的心力衰竭動物模型，提取其心肌組織RNA及蛋白，發(fā)現(xiàn)心肌組織LOX mRNA及蛋白表達均明顯升高，且與心肌細胞凋亡程度有關[12］。以上研究均表明，LOX在心肌纖維化中扮演重要角色。我們的研究表明，DCM組大鼠心肌纖維化明顯，心肌組織LOX顯著升高，與之前文獻描述的研究結果一致，提示LOX在糖尿病心肌病整個疾病的進展中發(fā)揮一定的作用。由此我們推測，下調LOX在糖尿病心肌病中的表達可能對治療糖尿病心肌病起到一定的作用。

他汀類藥物具有調脂外的多效性，目前有研究證實，阿托伐他汀可通過調節(jié)心肌組織金屬蛋白酶的表達來顯著緩解冠心病動物模型的心肌纖維化[13］。既往我們有研究表明，阿托伐他汀可通過調節(jié)LOX-p38-MMP-9信號軸對慢性心力衰竭小鼠的心肌組織發(fā)揮保護作用[3］。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，DCM組大鼠心肌纖維化明顯、心功能明顯下降，心肌組織LOX、MMP-2 mRNA和LOX、磷酸化p38及MMP-2蛋白表達明顯上調；相關分析發(fā)現(xiàn)，其心肌纖維化程度與LOX、MMP-2和磷酸化p38表達呈正相關。故我們推測，DCM大鼠左心室心肌纖維化可能與LOX-p38-MMP-2信號軸反應增強有關。應用阿托伐他汀干預DCM大鼠后，心肌組織LOX、MMP-2 mRNA和LOX、磷酸化p38及MMP-2蛋白表達。故我們推測，阿托伐他汀可通過LOX-p38-MMP-2信號軸減輕糖尿病心肌病大鼠心肌組織纖維化。而各組P38表達無明顯變化，分析阿托伐他汀對大鼠的心肌纖維化保護作用及MMP-2的表達可能是通過磷酸化的p38來實現(xiàn)的。

綜上所述，阿托伐他汀可通過LOX-p38-MMP-2信號軸減輕糖尿病心肌病大鼠心肌組織纖維化。