通絡刮痧和中藥對氣滯血瘀證雌性大鼠肝組織Nrf2表達影響的對比研究*

唐也笑， 萬荷天一， 羅小光*

(貴州醫科大學， 貴州 貴陽 550004)

氣滯血瘀證是由于氣機郁滯導致血行瘀阻所表現的證候[1]。《醫述》曰：“因憂思過度而致營血郁滯不行,或因怒傷血逆而留積于胸膈之間者，此皆瘀血之因也。”情志異常是氣滯血瘀證發病的重要原因。有學者認為[2]，氣滯血瘀證的發病機理和氧化應激存在關聯，氧化應激的主要攻擊器官是肝臟[3]，而肝臟等器官中有大量的Nrf2核轉錄因子表達[4]。Nrf2核轉錄因子是一種抗氧化正向調控因子，它不但能夠延長細胞壽命，維持細胞氧化還原穩態[5]，還能調節多基因表達并參與多種信號傳導途徑[6]。因此本課題通過建立氣滯血瘀證SD雌性大鼠模型，觀察通絡刮痧和桃紅四物湯對模型大鼠肝組織核因子E2相關因子2(Nrf2) mRNA及蛋白表達的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

實驗動物：40只6～8周齡、體質量為250～270 g的SPF級成年雌性SD大鼠，由長沙市天勤生物動物實驗中心提供，合格證號為SCXK(湘)2014-0010。主要實驗藥物及試劑：鹽酸腎上腺素注射液(天津金耀氨基酸有限公司，批號20170907)，水合氯醛(天津市致遠化學試劑有限公司，批號20180910)，刮痧精油。主要儀器設備及工具：TG16G臺式高速離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)，刮痧板等。

1.2 方法

1.2.1分組 將40只大鼠隨機分成空白組、模型組、中藥組以及刮痧組，每組10只。

1.2.2造模 動物適應性飼養1周后，根據文獻[7-9]制備氣滯血瘀證模型，除空白組外，其余3組大鼠左下腹注射鹽酸腎上腺素注射液0.09 mg/kg，1次/d；給藥4 h后隨機接受以下一種物理刺激：冰水浴，將大鼠置于0～4 ℃恒溫水箱，4 min/次,2次/d；烘箱熱烘，將大鼠置于50 ℃恒溫箱，10 min/次，2次/d；夾尾，將兩只大鼠鼠尾用同一根皮筋捆綁，大鼠發怒廝打時松開皮筋，20 min/次，2次/d；束縛，將大鼠用皮筋捆綁束縛，限制其活動1 h，2次/d；傾斜，將鼠籠45°傾斜放置，持續2 h，1次/d。每日給予以上1～2種不同刺激，持續14 d。空白組正常喂養，不做其他任何處理。

1.2.3造模后處理 治療造模成功后24 h，除空白組外，其它3組大鼠均采取不同的干預措施，模型組抓捕，1次/d；中藥組按照24 g/kg桃紅四物湯煎劑進行灌胃，1次/d；刮痧組用剃毛器剔除大鼠腹背部毛發,取用少量刮痧精油，涂勻在大鼠的暴露皮膚處，參考《大鼠穴位圖譜》[10]，用刮痧板刮拭大鼠膀胱經、督脈(頸部至尾骨)、任脈(頸部至恥骨)，以出紅色或紫紅色痧粒為止，以不刮破皮膚為度，頻率為1次/周，治療時間為2周。空白組正常喂養，不做其他任何處理。

1.2.4動物處死及標本采集 在末次治療次日早晨，予各組大鼠左下腹注射水合氯醛麻醉后，心臟采血后處死。5 mL血樣本采集入含肝素的采血管中、3 mL血樣本采集入枸櫞酸鈉采血管中，送至中心實驗室檢測全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度及血細胞比容等血液流變學指標和部分活化凝血酶原時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)及纖維蛋白原(FIB)等凝血功能指標；剖腹后取出肝組織放于離心空管中，并置于-80 ℃密封保存，取出部分肝組織后，用玻璃勻漿器研磨均勻，采用RT-PCR法檢測肝組織中Nrf2 mRNA的表達，Nrf2引物，上游5′-TCTGCTGCCATTAGTCAGTCGCTCTC-3′，下游5′-CCACCGTGCCTTCAGTGTGCTTCT-3′；β-actin引物，上游5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′,下游5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′。采用Western Blot法檢測肝組織中Nrf2蛋白的表達，嚴格按照說明書操作。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 血液流變學

從表1中可以發現，與空白組相比，模型組大鼠血液黏度以及血細胞比容升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，中藥組、刮痧組大鼠的血液黏度以及血細胞比容降低(P<0.05或P<0.01)；中藥組和刮痧組大鼠比較，血液流變學指標差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血液流變學指標比較Tab.1 The effect of scraping therapy and TCM on rat hemorheology

與空白組相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01；與模型組相比，(3)P<0.01，(4)P<0.05

2.2 APTT、TT、PT和FIB

從表2中可以發現，與空白組相比，模型組大鼠APTT和TT明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，中藥組、刮痧組大鼠APTT和TT明顯延長，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，PT、FIB差異無統計學意義(P>0.05)，中藥組和刮痧組大鼠TT、APTT、PT及FIB差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠PT、TT、APTT、FIB的比較Tab.2 The effect of scraping therapy and TCM on rat PT， TT，APTT and FIB

與空白組相比，(1)P<0.01；與模型組相比，(2)P<0.05，(3)P<0.01

2.3 肝組織Nrf2 mRNA及Nrf2 蛋白表達

RT-PCR技術檢測大鼠肝臟組織中Nrf2 mRNA的含量，Western Blot法測定肝臟組織中Nrf2蛋白含量，如圖1及圖2顯示，模型組大鼠肝組織中的Nrf2 mRNA及Nrf2蛋白高于空白組(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、刮痧組大鼠經治療后均可上調肝組織Nrf2 mRNA及蛋白表達(P<0.05或P<0.01)；而中藥組和刮痧組大鼠比較，差異無統計學意義。

(1)與空白組相比，P<0.05;(2)與模型組相比，P<0.05圖1 各組肝組織Nrf2 mRNA表達Fig.1 The effect of scraping and TCM on liver Nrf2 mRNA expression

(1) 與空白組相比，P<0.01;(2)與模型組相比，P<0.01圖2 各組肝組織Nrf2蛋白表達的比較Fig.2 The effect of scraping and TCM on liver Nrf2 protein expression

3 討論

氣滯血瘀證多由情志不舒、或外邪侵襲引起肝氣久郁不解所致[1]。本研究通過腹腔注射腎上腺素模擬氣滯，并施以不可預見性應激刺激來建立符合中醫特點的氣滯血瘀證大鼠模型。從以往研究者對氣滯血瘀證雌性大鼠模型的報道來看，血液流變學是氣滯血瘀證的客觀診斷標準，凝血功能與氣滯血瘀證密切相關[8,11-12]。因此本課題選用血液流變學和凝血指標，判斷所建立的大鼠模型是否符合中醫氣滯血瘀證特點。本次實驗研究結果表明，與空白組相比，模型組的血液黏度、血細胞比容都升高(P<0.05或P<0.01)，TT、APTT時間明顯縮短(P<0.01)，符合中醫氣滯血瘀證診斷標準。

氧化應激(oxidative stress)是由于機體活性氧類產生，超過機體內源性抗氧化防御水平而造成的一種氧化和抗氧化失衡狀態[13]。氣滯血瘀證會引起氧化應激[2]，氧化應激會損傷女性的生殖能力并誘發一系列婦科疾病，如痛經、閉經、卵巢早衰、心血管疾病、肥胖病、更年期綜合征女性諸多疾病[14]。“女子以肝為先天”，肝氣郁滯是氣滯血瘀證女性疾病的主要病因病機，這與古人認為的“女性情緒的多變性易引起肝氣不疏，導致肝氣郁結”觀點不謀而合,因此選擇肝組織作為本次實驗的研究對象。在氧化應激反應中，Nrf2轉錄因子起著重要氧化-抗氧化的調控作用，并且在肝臟的表面有Nrf2轉錄因子的大量表達[4]。本研究選擇大鼠肝組織Nrf2轉錄因子，究其原因是該因子不但能夠延長細胞壽命、維持細胞氧化還原穩態[5]，還可以在氧化應激狀態下保護肝臟[15]。在正常生理狀態下，細胞漿內Nrf2與Keap1結合，當機體ROS水平升高處于氧化應激狀態時，Nrf2與Keap1解離，經磷酸化的Nrf2轉移至細胞核，與細胞核內的小Maf蛋白結合形成二聚體，與ARE啟動NQO1、HO-1、SOD等Ⅱ相解毒酶的轉錄，翻譯后細胞內Ⅱ相解毒酶增加，可加速ROS的清除和代謝，增強組織細胞的抗氧化能力，消除或減輕氧化應激損傷[16-19]。因此肝組織Nrf2表達是否上調可提示能否提高肝組織的抗氧化能力，從而抑制氧化應激。本次實驗的數據顯示，經治療干預后的大鼠模型Nrf2 mRNA及蛋白的表達均上調(P<0.05或P<0.01)，促使肝組織的抗氧化能力提高，抵抗氧化應激。

桃紅四物湯源于清朝年間知名醫家吳謙所著《醫宗金鑒》，它不但能夠改善機體的凝血功能，降低血液黏度，抑制PLT的粘附和聚集；還能夠有效上調組織Nrf2的表達[20-21]。本課題實驗結果也支持以上觀點，與模型組對比，中藥組的血液黏度、血細胞比容均降低(P<0.05)，TT、APTT時間均延長(P<0.05)，肝組織Nrf2 mRNA及蛋白表達上調(P<0.05或P<0.01)。該藥方不僅具有活血化瘀的作用，而且能夠提高肝組織抗氧化作用，同時還是婦科血瘀證治療常用的代表方，因此本實驗以桃紅四物湯灌胃治療作為治療對照組。

通絡刮痧是基于臟腑-經絡-穴位中醫皮部理論，用刮痧板等工具在相應經絡和穴位進行刮拭，起到刺激作用。通絡刮痧除了具有調氣行血、活血化瘀、舒筋通絡等功效，廣泛應用于各種病癥的治療和保健領域，還能夠提高肝組織抗氧化能力[22]。由本課題實驗結果可見，模型組對比，刮痧組血液黏度降低(P<0.01)、血細胞比容降低(P<0.05)，TT延長(P<0.05)、APTT延長(P<0.01)，肝組織Nrf2 mRNA及蛋白的表達(P<0.05或P<0.01)，刮痧組和中藥組各指標之間差異無統計學意義，提示通絡刮痧和中藥治療的作用類似，均能上調肝組織Nrf2 mRNA及蛋白質的表達，從而達到提高肝的抗氧化能力，抑制氧化應激的目的。

總之，通絡刮痧和桃紅四物湯均能降低氣滯血瘀證模型雌性大鼠的血液黏度、改善凝血功能、上調肝組織Nrf2 mRNA及蛋白的表達，兩者的作用效果類似，無論從蛋白層面還是基因層面均提示兩種治療方法的作用機制均可能與提高肝組織抗氧化能力，改善氧化應激狀態有關。由此有理由認為，肝組織Nrf2相關的具體信號通路及機制可能成為治療和預防女性疾病的潛在抗氧化靶點，值得深入研究。