HPLC-MS/MS法手性拆分泮托拉唑鈉對(duì)映體及大鼠血漿中藥代動(dòng)力學(xué)研究

袁艷娟，劉 晶，邵 卿，喬紅群

(南京工業(yè)大學(xué)，江蘇省藥物研究所，江蘇省藥物安全性評(píng)價(jià)中心，江蘇 南京 211800)

泮托拉唑是一種選擇性質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)，治療酸相關(guān)的胃腸道疾病。所有PPIs，包括奧美拉唑、泮托拉唑、蘭索拉唑等，都具有手性苯并咪唑亞砜結(jié)構(gòu)，現(xiàn)臨床上使用藥物多為其消旋體結(jié)構(gòu)[1]。手性化合物的拆分通常在正相色譜條件下可以獲得較好的分離效果，但是，反相手性色譜具有毒性小、成本低的優(yōu)點(diǎn)，并與實(shí)際樣品具有很好的相容性。現(xiàn)已報(bào)道的泮托拉唑鈉手性分離方法包括高效液相色譜-紫外檢測(cè)(HPLC-UV)法[2-5]和多維色譜分離法[6]，但是這些方法的選擇性差、靈敏度低、耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)。因此，有必要開(kāi)發(fā)一種全新的量化方法對(duì)血漿中泮托拉唑鈉對(duì)映體進(jìn)行手性拆分。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)越來(lái)越多地應(yīng)用于手性藥物分離。Chen等[1]用APCI源手性分離泮托拉唑?qū)τ丑w；程艷玲等[7]、曹曉麗等[8]通過(guò)HPLC-MS/MS法，ESI+模式，使用手性色譜柱檢測(cè)犬血漿中泮托拉唑?qū)τ丑w。

本研究擬建立Chiralpak IE色譜柱手性拆分泮托拉唑?qū)τ丑w的HPLC-MS/MS方法，采用ESI-模式分離大鼠血漿樣本中左右旋泮托拉唑。同時(shí)，按照《中國(guó)藥典》2015年版附錄“生物樣本定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證[9]，并應(yīng)用該方法研究大鼠單劑量藥代動(dòng)力學(xué)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，配有在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱；API4000+三重四極桿質(zhì)譜儀、電噴霧離子化源：美國(guó)AB Sciex公司產(chǎn)品，配有Analyst1.6.2軟件；Chiralpak IE色譜柱：大賽璐藥物手性技術(shù)上海有限公司產(chǎn)品。

左旋泮托拉唑鈉(純度99.9%)、右旋泮托拉唑鈉(純度99.8%)：陜西合成藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；雙氯芬酸鈉：由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供； SD大鼠：由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供；乙腈、甲醇、甲酸：均為美國(guó)Tedia公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1色譜條件 色譜柱：Chiralpak IE柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；等度洗脫：A-B(30∶70，V/V)；流速：0.9 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：5 μL。

1.2.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源負(fù)離子模式(ESI-)；電噴霧電壓(IS)-4 500 V；溫度550 ℃；源內(nèi)輔助氣1(GS1，N2)壓力344.7 kPa，源內(nèi)輔助氣2(GS2，N2)壓力344.7 kPa；氣簾氣(CUR，N2)壓力172.4 kPa；碰撞氣(CAD，N2)壓力48.3 kPa；解簇電壓(DP)：左、右旋泮托拉唑-60 V，內(nèi)標(biāo)雙氯芬酸鈉-45 V；碰撞能量(CE)：左、右旋泮托拉唑-16 V，內(nèi)標(biāo)雙氯芬酸鈉-14 V；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；用于定量分析的離子對(duì)：左、右旋泮托拉唑m/z382.0>229.8，內(nèi)標(biāo)雙氯芬酸鈉m/z293.9>249.6。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱(chēng)取適量的左、右旋泮托拉唑鈉對(duì)照品，分別置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成1 g/L的左旋泮托拉唑鈉、右旋泮托拉唑鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

稱(chēng)取適量的雙氯芬酸鈉對(duì)照品，置于10 mL容量瓶中，用乙腈-水溶液(50∶50，V/V)定容，得1 g/L內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。用乙腈稀釋成濃度為500 μg/L的溶液，作為內(nèi)標(biāo)工作液。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

選用SD大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不禁水，靜脈推注給藥，劑量為低(4 mg/kg)、中(8 mg/kg)和高(16 mg/kg)。同時(shí)設(shè)立右旋對(duì)照組(8 mg/kg)和消旋對(duì)照組(16 mg/kg)，每組6只動(dòng)物，雌雄各半。通過(guò)大鼠眼底靜脈叢采集全血(每只動(dòng)物約0.2～0.4 mL/次)，采血時(shí)間為給藥前0 min，給藥后第2、5、15、30、60、90、120、150、180、240、300 min。血液采集至肝素鈉(10 U)抗凝的EP管中，充分搖勻，離心后取出血漿，于-20 ℃保存，待測(cè)。

1.5 大鼠血漿樣本預(yù)處理

待測(cè)血漿樣品(-20 ℃)于室溫下自然解凍后，精密吸取25 μL，置于1.5 mL離心管中，精密加入150 μL內(nèi)標(biāo)溶液(500 μg/L雙氯芬酸鈉)，渦旋3 min，以16 000 r/min離心5 min，取150 μL上層溶液至1.5 mL離心管中，再次以16 000 r/min離心5 min，取5 μL上層溶液進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-MS/MS條件優(yōu)化

本研究對(duì)檢測(cè)模式及色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，分別考察了ESI+、ESI-模式下，大鼠血漿樣本中泮托拉唑鈉對(duì)映體的手性拆分。結(jié)果表明，ESI+模式下基質(zhì)效應(yīng)比較明顯；而ESI-模式無(wú)基質(zhì)效應(yīng)，靈敏度高，定量限可達(dá)5 μg/L，能夠滿(mǎn)足本研究檢測(cè)要求。

以5 mmol/L甲酸銨水溶液、5 mmol/L乙酸銨水溶液、0.1%甲酸水溶液、0.1%乙酸水溶液與甲醇、乙腈組成流動(dòng)相體系，考察左、右旋泮托拉唑的分離效果。結(jié)果表明，左、右旋泮托拉唑在乙腈體系下的峰形及響應(yīng)明顯優(yōu)于甲醇體系。5 mmol/L甲酸銨水溶液、5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈體系在梯度條件下和0.1%甲酸水溶液-乙腈體系在等度條件下均能較好地分離血漿中左、右旋泮托拉唑。但因等度洗脫條件較梯度條件簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，本實(shí)驗(yàn)最終選擇0.1%甲酸水溶液-乙腈等度洗脫體系。

2.2 血漿樣本預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了液液萃取和蛋白沉淀方法對(duì)血漿樣本進(jìn)行預(yù)處理。分別采用乙酸乙酯、乙醚、正己烷、甲基叔丁基醚作為萃取劑，乙腈、甲醇作為沉淀劑，進(jìn)行血漿樣本預(yù)處理優(yōu)化。結(jié)果表明，正己烷不能將泮托拉唑從血漿中提取出來(lái)，乙醚和甲基叔丁基醚的提取回收率約為80%，而使用乙酸乙酯作為萃取劑時(shí)，提取回收率大于85%。甲醇作為沉淀劑時(shí)存在基質(zhì)干擾，乙腈則無(wú)基質(zhì)干擾，提取回收率與乙酸乙酯液液萃取效率相當(dāng)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈蛋白沉淀方法進(jìn)行血漿樣本預(yù)處理。

2.3 選擇性研究

取6只大鼠的空白血漿，按2.2節(jié)方法處理，在1.2.1節(jié)條件下分別檢測(cè)空白血漿(圖1)、空白血漿添加左旋和右旋泮托拉唑鈉(圖2～3)、空白血漿添加內(nèi)標(biāo)(圖4)的特異性。由圖1～4可見(jiàn)，左旋、右旋泮托拉唑保留時(shí)間分別為6.43 min和5.03 min，二者均能實(shí)現(xiàn)基線分離，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為4.63 min，各檢測(cè)物峰形良好。血漿中生物基質(zhì)對(duì)左旋和右旋泮托拉唑無(wú)干擾，方法具有較高的特異性。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

使用空白血漿配制左旋、右旋泮托拉唑濃度分別為5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000和5 000 μg/L的血漿樣本，按2.2節(jié)方法操作，進(jìn)行色譜分析。經(jīng)驗(yàn)證，在該實(shí)驗(yàn)條件下，左旋和右旋泮托拉唑血漿樣品的線性范圍均為5.0～5 000.0 μg/L，最低定量限均為5.0 μg/L。

注：a.左、右旋泮托拉唑離子對(duì)；b.內(nèi)標(biāo)離子對(duì)圖1 空白血漿圖譜Fig.1 Chromatograms of blank plasma

注：a.左、右旋泮托拉唑離子對(duì)；b.內(nèi)標(biāo)離子對(duì)圖2 血漿樣本中添加左旋泮托拉唑圖譜Fig.2 Chromatograms of plasma samples supplemented with L-pantoprazole sodium

注：a.左、右旋泮托拉唑離子對(duì)；b.內(nèi)標(biāo)離子對(duì)圖3 血漿樣本中添加右旋泮托拉唑圖譜Fig.3 Chromatograms of plasma samples supplemented with D-pantoprazole sodium

注：a.左、右旋泮托拉唑離子對(duì)；b.內(nèi)標(biāo)離子對(duì)圖4 空白血漿樣本中添加內(nèi)標(biāo)圖譜Fig.4 Chromatograms of blank samples with internal standard

2.5 基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

取空白溶液及分別來(lái)源于6只大鼠的空白血漿，配制成左旋、右旋泮托拉唑濃度分別為10、50、500、2 000 μg/L的無(wú)基質(zhì)及基質(zhì)樣本，考察基質(zhì)效應(yīng)。檢測(cè)得到峰面積分別為A2、A1，詳細(xì)結(jié)果列于表1。左旋泮托拉唑基質(zhì)效應(yīng)分別為96.4%、96.8%、107.2%、109.4%，右旋泮托拉唑基質(zhì)效應(yīng)分別為96.1%、98.8%、104.7%、101.7%。

2.6 提取回收率實(shí)驗(yàn)

取大鼠空白血漿，配制成左旋、右旋泮托拉唑濃度分別為10、50、500、2 000 μg/L的血漿樣本，考察提取前后的回收率，結(jié)果列于表2。左旋泮托拉唑的方法回收率為96.4%、106.8%、97.9%、114.3%，右旋泮托拉唑的方法回收率為112.8%、105.2%、91.1%、108.6%。

表1 左旋泮托拉唑、右旋泮托拉唑、內(nèi)標(biāo)在大鼠血漿中的基質(zhì)效應(yīng)(n=6)Table 1 Matrix effects of D, L-pantoprazole and internal standard in rat plasma (n=6)

注：A1、A2分別為右旋、左旋泮托拉唑的峰面積

表2 左旋泮托拉唑、右旋泮托拉唑、內(nèi)標(biāo)在大鼠血漿中的提取回收率(n=6)Table 2 Recoveries of D, L-pantoprazole and internal standard in rat plasma (n=6)

2.7 精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

按2.4節(jié)方法配制10、50、500、2 000 μg/L四種不同濃度的血漿樣本各5份，按2.2節(jié)方法操作，一天配制一批精密度樣品及一條隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，連續(xù)測(cè)試3天，共3批，結(jié)果列于表3～4。結(jié)果表明，批間和批內(nèi)精密度均小于10%，批間和批內(nèi)準(zhǔn)確度在85%～115%之間。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按照2.4節(jié)方法配制左旋和右旋泮托拉唑的低(10 μg/L)、中(50 μg/L)、高(2 000 μg/L)三個(gè)濃度血漿樣本，反復(fù)凍融3次，于37 ℃水浴解凍后，提取測(cè)定藥物濃度，考察反復(fù)凍融穩(wěn)定性。將血漿樣本放置于室溫下24 h，提取測(cè)定其藥物濃度，考察血漿樣本放置穩(wěn)定性。將提取的樣品于4 ℃放置48 h，測(cè)定其濃度，考察進(jìn)樣瓶中放置穩(wěn)定性。將含藥血漿置于-20 ℃冰箱中冷藏9個(gè)星期，提取測(cè)定藥物濃度，考察其長(zhǎng)期穩(wěn)定性。結(jié)果表明，血漿中左旋和右旋泮托拉唑在以上各種穩(wěn)定性研究實(shí)驗(yàn)條件下均能保持穩(wěn)定。

表3 大鼠血漿樣品中左旋泮托拉唑的批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度(n=6)Table 3 Intra- and inter-assay precision and accuracy of L-pantoprazole in rat plasma samples (n=6)

表4 大鼠血漿樣品中右旋泮托拉唑的批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度(n=6)Table 4 Intra- and inter-assay precision and accuracy of D-pantoprazole in rat plasma samples (n=6)

2.9 稀釋可靠性與殘留考察

配制超出線性范圍濃度的含藥血漿，使用空白血漿稀釋2倍和100倍作為稀釋樣本，提取并測(cè)定其中的藥物濃度。結(jié)果表明，血漿樣本稀釋過(guò)程對(duì)測(cè)定結(jié)果并無(wú)影響。

在標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度后進(jìn)行雙空白樣本檢測(cè)，考察其殘留。結(jié)果表明，血漿樣本檢測(cè)無(wú)殘留。

2.10 大鼠藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果

大鼠靜脈注射給予4、8、16 mg/kg的注射用左旋泮托拉唑鈉后，平均血藥濃度-時(shí)間曲線示于圖5，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)列于表5。大鼠靜脈注射給予消旋對(duì)照品后，左、右旋泮托拉唑平均血藥濃度-時(shí)間曲線示于圖6，右旋泮托拉唑藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)列于表6。

圖5 左旋泮托拉唑平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.5 Average plasma concentration-time curve

表5 左旋泮托拉唑藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)均值(n=6)Table 5 Average of L-pantoprazole pharmacokinetic parameters (n=6)

注：t-test與低劑量組相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01；與中劑量組相比，#表示p<0.05

圖6 左、右旋泮托拉唑平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.6 Average plasma concentration-time curve

低、中、高劑量組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在4～16 mg/kg劑量范圍內(nèi)，左旋泮托拉唑在大鼠體內(nèi)的暴露隨劑量增大而增加，而MRT、t1/2、Vz等參數(shù)不會(huì)隨劑量出現(xiàn)明顯的改變。

統(tǒng)計(jì)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，大鼠靜脈給予注射用泮托拉唑鈉后，左、右旋泮托拉唑在動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為略有不同：左旋對(duì)映體暴露水平略高于右旋；右旋對(duì)映體存在時(shí)可增加左旋對(duì)映體在大鼠體內(nèi)的暴露水平，降低其清除率；而左旋對(duì)映體對(duì)右旋對(duì)映體的藥代動(dòng)力學(xué)行為無(wú)明顯影響。

表6 右旋泮托拉唑藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)均值(n=6)Table 6 Average of D-pantoprazole pharmacokinetic parameters (n=6)

注：t-test與消旋對(duì)照組左/右對(duì)映體相比，*表示p<0.05

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了Chiralpak IE色譜柱手性拆分泮托拉唑?qū)τ丑w的HPLC-MS/MS分析方法。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，左旋和右旋泮托拉唑在血漿基質(zhì)下能基線分離，空白血漿無(wú)干擾，方法選擇性良好，二者線性范圍均為5.0～5 000.0 μg/L，最低定量限均為5.0 μg/L。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法回收率、基質(zhì)效應(yīng)、精密度、準(zhǔn)確度、殘留及稀釋過(guò)程均符合生物樣本分析要求。將該方法應(yīng)用于大鼠血漿樣本中左旋、右旋泮托拉唑鈉藥代動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果可靠，可用于生物樣本中泮托拉唑鈉對(duì)映體的痕量分析。